PhenoCycler-Fusion 45个超多蛋白靶标探索头颈鳞状细胞癌免疫治疗生物标记物 ... ...

头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)是第七大常见癌症，约50%患有该种癌症的患者寿命可超过5年，是预后相对较好癌种。当前研究显示，免疫检查点抑制剂(ICIs)在复发或转移性(R/M) HNSCC患者中显示出不错的效果，然而，目前只有小部分患者从免疫治疗中受益。研究表明，HNSCC的肿瘤微环境(TME)是治疗反应的主要因素，了解TME，特别是通过空间蛋白组学的方法来确定其中的细胞和分子成分可以帮助确认与免疫治疗有效性密切相关的生物标记物。

澳大利亚昆士兰大学学者与Akoya Biosciences公司研究人员合作，通过对头颈部鳞状细胞癌肿瘤微环境分区空间分析，来确定免疫检查点分子和肿瘤坏死因子受体超家族成员作为免疫治疗反应的生物标志物。

该项研究对来自澳大利亚一家医院的HNSCC患者治疗前组织的蛋白质进行了靶向空间分析，以确定肿瘤和间质边缘上与免疫治疗响应相关的新生物标志物。根据实体瘤响应评价标准(RECIST)，研究人员将患者分为响应和无响应组，通过空间分析研究样本中肿瘤组织与间质组织中相关分子和细胞分布的差异。研究发现免疫检查点分子，包括PD-L1、B7-H3和VISTA存在差异表达。

响应组在肿瘤区域中的PD-L1和B7-H3的表达明显升高，而VISTA的表达则偏低。对反应亚组分析表明，肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员包括OX40L、CD27、4-1BB、CD40和CD95/Fas与免疫治疗结果相关。CD40在缓解患者中的表达高于未缓解患者，而CD95/Fas在部分缓解(PR)患者中的表达低于疾病稳定(SD)和进展性疾病(PD)患者。此外，研究还发现肿瘤区域而非间质中4-1BB的高表达与更好的总生存率(OS)相关(HR= 0.28, p调整后=0.040)。

此外，CD40在肿瘤区域的高表达(HR= 0.27, p= 0.035)和CD27在基质中的高表达(HR= 0.2, p调整后=0.032)与更好的生存结果相关。综上所述，本研究支持免疫检查点分子的作用，并暗示TNFR超家族在HNSCC队列中是免疫治疗响应的关键参与者。

在获得不同蛋白靶标表达差异后，研究人员需要了解哪些细胞表达了这些靶标，具体哪些细胞的高表达与ICI治疗密切相关，研究人员使用了Akoya Biosciences的PhenoCycler-Fusion对组织上的细胞进行单细胞空间表型分析。文章使用的靶标组合包括15个免疫细胞分型抗体，13个髓系淋巴细胞分型和组织结构相关抗体以及17个免疫活性相关抗体，共45个靶标。具体靶标组合如下：

研究对45个靶标标记的单细胞组织原位图像进行质控和细胞分割，细胞分割采用了Akoya推荐的基于Stardist的细胞分割方案。随后计算了每个细胞的核，质和膜上每种抗体的平均表达强度，并对每种蛋白的表达量进行均一化。

研究人员还使用Harmony方法，基于17个谱系标记（CD163, CD68, CD19, CD20, CD21, CD3e, CD8, CD4, CD45RO,ICOS, FOXP3, E-CAD, Pan-Cytokeratin, Beta-Catenin, CD31, CD34,SMA）对不同切片间的表达差异进行了均一化。统一不同样本之间的表达量后，研究人员基于样本上不同细胞的靶标表达差异对细胞进行了聚类和分型，并绘制了相应的热图。

基于单细胞分辨率的组织原位标记，不仅可以对细胞表型进行分类，还可以按照不同细胞对标记靶标的表达情况进行聚类，找到与ICI治疗响应相关的细胞类群。

通过对4组响应情况不同患者的细胞亚群分布情况进行对比，下图展示了CR, PR, SD和PD四组患者panCK (红), CD45(绿), DAPI (蓝)和 E-cadherin (粉)阳性细胞的分布情况（图A-D）；不同细胞分型的分布差异（图E-H）；不同分型细胞的比例差异（图I-L）；不同靶标在不同细胞分型中的表达量差异热图（图M）；以及这四种分型样本中不同细胞类型分布差异的柱状图（图N）。

将组织基于肿瘤，肿瘤边缘和基质区域的区别可分为三个区域（如下图ABCD），分别统计CR，PR，SD和PD三组患者这三个区域中的细胞分布差异（下图EFG），发现相比于SD组和PD组，CR与PR组中B细胞和CD8+T细胞的比例更高。在响应组中，肿瘤相关B细胞和肿瘤相关T细胞浸润比例更高。

PhenoCycler-Fusion所提供的单细胞分辨率超多蛋白靶标全组织成像能力，可以帮助研究者以单细胞为单位对肿瘤微环境进行详细分型和定量分析。目前PhenoCycler-Fusion可实现在一张切片上超过100种以上的蛋白靶标标记，对肿瘤微环境中各种相关细胞类型进行详细分型，并且基于这些细胞所表达蛋白的差异进行多维度分析。

参考文献

1. Sadeghirad H, Liu N, Monkman J, Ma N, Cheikh BB, Jhaveri N, Tan CW, Warkiani ME, Adams MN, Nguyen Q, Ladwa R, Braubach O, O’Byrne K, Davis M, Hughes BGM and Kulasinghe A (2023) Compartmentalized spatial profiling of the tumor microenvironment in head and neck squamous cell carcinoma identifies immune checkpoint molecules and tumor necrosis factor receptor superfamily members as biomarkers of response to immunotherapy. Front. Immunol. 14:1135489.doi: 10.3389/fimmu.2023.1135489