干货 | 优化多重PCR检测，实现效果最大化

多重PCR（multiplex PCR）是在同一PCR反应体系里加上二对或二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应。其反应原理、反应试剂和操作过程与一般PCR相同。相比传统的qPCR等分子诊断手段，多重PCR拥有多重、准确、高通量的优势。

由于多重PCR在检测上表现出很大的灵活性，既有单个PCR的特异性和敏感性，又比较快捷和经济，自出现以来被广泛应用于临床分子诊断项目：病原微生物检测、病毒检测、遗传病诊断、肿瘤检测等；检验检疫项目：植物检疫、动物检疫、食品检测、卫生检疫等场景在内的诸多领域。

需要指出的是，多重PCR实验并不是简单地将多对特异性引物混合成一个反应体系。多重PCR之所以难，在于多个靶点之间扩增条件不兼容，每个靶点都需要旁边其他的引物配合，就像“绑腿跑”。

对于单一PCR，单个靶点的成功扩增，需要被捆绑在一起的“选手”（一对引物）配合默契。而多重PCR需要多对“选手”同时起跑又同时到达，这就要求所有参赛的每对“选手”都有非常默契的配合，才能获得均衡的发挥。这相当于从“校内小组赛”转为“校间团体赛”，难度可见一斑。

因此，多重PCR实际操作过程中的扩增效果和扩增的片段数往往不尽如人意。而为了达到更好的扩增效果，可以从以下两方面进行优化：

多重PCR的反应体系是影响扩增效果的重要因素之一，体系中的各组分需满足每对引物对应的靶点的扩增量的要求。反应体系包括引物、模板、缓冲液、逆转录酶，DNA聚合酶、dNTP和Mg²⁺等，其中酶起到了关键性的作用。

多重PCR反应中会存在以下两种问题：

1）目的产物长度不尽相同，而较小片段总是优先得到扩增；

2）各对引物的最佳PCR条件也不尽相同，比如较长片段需要更长的延伸时间。

因此，为了保证最终扩增产物的量尽可能的一致，在优化反应条件的时候，建议尽可能选择有利于较大片段扩增的条件。

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