《自然》子刊：巨噬细胞可转变成智能病原体检测器

目前，平板培养被广泛用于细菌鉴定;然而，这种方法的主要缺点在于分析时间长(通常超过48小时)，并且需要专门的培养条件，这限制了它的速度和可用性。使用核酸引物的核酸检测(如PCR)具有极好的灵敏度，但这些检测的工作流程复杂(如细胞裂解、核酸提取、磁分离、洗涤和扩增等)，并且需要昂贵的蛋白质酶和热循环。免疫测试，如基于侧流试纸的检测简单，成本低，快速信号生成。然而传感器的设计和部署需要筛选和优化。同时，要提前了解目标细菌的信息。当病原体未知时，很难选择合适的生物受体来捕获和检测细菌。

在数百万年的进化过程中，先天免疫细胞，如巨噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞，已经优化了对广谱病原体及其毒力因子的识别能力。这些免疫细胞依赖于一组表面受体，如toll样受体(TLRs)、甘露糖受体（MR）、清道夫受体（SR）和补体受体（CR）等，来结合病原体的特定成分。然而，由于以下原因，开发免疫细胞作为一种能够有效识别、丰富和报告特定病原体的智能探测器仍然是一个巨大的挑战。首先，活Møs的机械稳定性较低，对各种操作都很脆弱，容易损坏。其次，细胞不容易操作，不便于常规应用。最后免疫细胞不能区分特定的细菌种类，更不用说产生可检测的信号。

近日，一组来自中国的研究团队在杂志Nature communications上发表了一篇题为“A smart pathogen detector engineered from intracellular hydrogelation of DNAdecorated macrophages”的文章。作者报告了一种简单的策略，通过结合细胞内水凝胶技术和DNA纳米技术，将活的Møs转化为智能细菌探测器。这种方法有几个好处：(1)GMøs具有坚固的凝胶内核和完整的细胞膜，可耐受恶劣环境。(2)可以利用磁性分离方便地将细菌吸附的GMøs从复杂的生物介质中分离出来。(3) GMøs可以高效地识别、捕获和丰富广谱细菌到其表面。(4)GMøs可以用响应性DNA元件(如DNAzyme)修饰，用于使用捕获和检测策略进行特定细菌的生物传感以及细菌相关毒素的分析。

dna修饰凝胶巨噬细胞(DNA-GMøs)的制备过程如下图所示。首先将Møs与超顺磁性氧化铁纳米颗粒孵育，以获得磁性细胞。同时使用细胞因子(如IL-4)诱导病原体结合受体(如MR和CD163)的上调。然后通过直接渗透光引发剂和单体，以及随后的紫外线照射，实现胞内水凝胶化。最后，响应特定细菌的DNA传感元件(例如DNAzyme)可以很容易地修饰在凝胶细胞上，以便方便，快速和高灵敏度的荧光读数。因此，产生了能够识别、富集和检测多种微生物的磁性DNA-GMøs。并且作者使用了不同的技术证实了DNA-GMøs的成功制备。

为了评估DNA-GMøs的稳定性，作者对细胞进行了不同条件的处理，如高渗、反复冻融循环、超声、高速离心和长时间储存(30天)。相比活Møs (LMøs)和多聚甲醛固定Møs (FMøs)在上述环境的脆弱性，DNA-GMøs在所有条件下都存活了下来，细胞形态和数量的变化可以忽略不计。总的来说，这些结果证实了DNA-GMøs的高稳定性，从而促进了它们在下游的应用，如病原体捕获和检测。

作者还对其在细胞膜上修饰的DNA分子的稳定性进行了评价。由于细胞是凝胶化的，锚定的DNA链没有内化到细胞中，可以在膜上存在很长一段时间而没有明显的损失(2周，下图c)。且在复杂生物介质(即10%的血清)中，双胆固醇标记的DNA修饰的GMøs的荧光保持不变，这意味着DNA链从GMøs上脱落可以忽略不计。

接下来，作者以革兰氏阴性大肠杆菌(E. coli)和革兰氏阳性金黄色葡萄球菌(S. aureus)两种具有代表性的细菌作为模型病原体，检测了GMøs结合和分离病原体的性能。结果显示，经过GMøs与菌悬液孵育15 min后，用磁铁收集细胞颗粒，成功捕获细菌，且受IL -4激活的GMøs的捕获能力都比未激活的GMøs要好得多(下图a)。

GMøs可用于捕获其他微生物，包括铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)、副溶血性弧菌(V. parahemolyticus)、肠炎沙门氏菌(S. enteritidis)和白色念珠菌(C. albicans)。当三种细菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌)混合在一个样品中时，GMøs可以同时捕获所有物种，从而证明了GMøs的广谱捕获能力。与传统的抗体修饰磁珠(ab - mb)不同，GMøs的捕获能力不受复杂介质的影响，这进一步强调了它们的优势。

作者在GMøs上修饰了靶向大肠杆菌的DNAzymes(称为DzEC-GMøs)，可用于检测活的大肠杆菌。在没有大肠杆菌的情况下，DzEC-GMøs荧光可以忽略不计，表明这种基于细胞的传感器的背景信号较低。一旦细菌被捕获，在细胞膜周围观察到强烈的绿色荧光。LOD约为500 CFU/毫升，且具有高度特异性，其他细菌如金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、副溶血性弧菌、化脓性链球菌和白色念珠菌不能产生可检测的信号。

当作者在细胞膜上修饰了两个针对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的DNAzymes(称为DzECSA- GMø)(下图h)。每一种用荧光团(FITC或Rh)标记的酶都可以与相应的细菌分泌的CEMs结合并切割其底物，从而恢复荧光。在样品中引入两种细菌中的一种使特定的荧光信号恢复，添加两种细菌同时存在时，才能同时观察到两种荧光团信号(下图i)。

GMø膜与目标毒素之间的结合事件导至细胞膜上形成孔隙，从而促进碘化丙啶的渗透。在没有Hlα的情况下，GMøs在实验过程中保持黑暗状态。加入100 nM的Hlα后，红色荧光逐渐显现，并在25 min时达到平稳。实验结果表明，PI染色法检测Hlα的检出限(LOD)估计为10 fM。

作者还使用DzSA-GMøs对当地某医院金黄色葡萄球菌引起的肺炎患者的真实痰样本进行了分析。在本实验中，金黄色葡萄球菌存在于样品中会激活DNAzymes，在细胞膜上产生绿色荧光，而Hlα导至PI荧光增加。如下图f所示，所有患者样本均产生金黄色葡萄球菌阳性信号。同时，PI染色实验显示，并非所有金黄色葡萄球菌都分泌Hlα(即P2和P5)。结果表明，该方法具有快速分析临床样品中细菌和毒素的能力。

作者已经开发了一种纳米工程方法，将天然Møs转化为病原体检测器。与天然细胞相比，细胞内Møs的水凝胶作用大大提高了它们的机械稳定性，并且通过MNPs的内化成功磁化Møs也提高了它们的可操作性。由于制备过程温和，GMøs不仅保留了捕获和丰富广谱微生物的识别能力，而且还可以用DNA传感元件进行修饰，以便在一次检测中特异性报告多种类型的细菌。此外，利用单细胞分析平台，可以分析微生物对免疫细胞的影响，并可以定量病原菌分泌的外毒素，与传统方法相比，性能有所提高。扩展自然存在实体的功能是生物技术中令人兴奋的领域之一，此研究在不涉及复杂遗传操作的情况下实现了这一概念，允许许多其他细胞和DNA元件共同用作指导细胞检测和临床诊断的智能工具。