DNBSEQ-G99基因测序仪分析（上）

今天我们来简单谈一下华大智造刚刚发布的基因测序仪新产品——DNBSEQ-G99。

8848……

1.在测序速度和检测通量灵活性上，DNBSEQ-G99是一款可以很好的满足临床尤其是入院需求的产品。不管是做mNGS（按SE75，20M reads/样本，可以做8-10个/Run）还是基于组织的肿瘤大Panel都很合适（按PE150，5Gb/样本，8-12个/Run），但不知道何时可以获得NMPA批准，是否还可以走“同品类医疗器械”来免临床试验。

2.确实很快。～2min/cyc（70s左右的生化流体时间+50s左右的信号采集时间）,华大智造在宣传时用了“全球最快的中小通量测序仪之一”的描述，虽然如果只看Cycle Time，Illumina的iSeq100也差不多（PE150 17.5小时的运行时间中测序部分的时间约12小时，Cycle Time也在~2min的水平），但iSeq100毕竟只有4M reads/Flow Cell而且是CMOS芯片采集荧光信号，不是落射式的光学系统。

DNBSEQ-G99为什么这么快，华大智造主要提到了3点：

第1，采用了“信号点正三角形矩阵排列（之前为正方形矩阵排列）”的测序芯片和超分辨率物镜。先说前者，众所周知，如下图所示：使用单一且等大的正多边形可以实现“密铺”的只有“正三角形、正四边形和正六边形”。

那为何DNBSEQ-G99 测序芯片的信号矩阵要从“正四边形”排列改成“正三角形”？如图2 所示，在Pitch（两信号点的中心间距）保持不变的情况下，相同面积的芯片上，“正三角形矩阵排列”可以大大提高芯片的利用率或者也可以理解为提高信号点密度。例如示意图2左侧的“正三角形矩阵排列”的信号点共有63个，而右侧“正四边形矩阵排列”的信号点则只有49个，“正四边形”变“正三角形”后，芯片利用率或者信号密度可提高近30%。另外，华大智造最近也提到了其DNBSEQ-T7在数据产量方面的升级（从6Tb提升至7Tb）,这是否也得益于T7的7T芯片改用“三角形阵列排布”？

行业内其他公司又是如何做的呢？如图3、图4所示illumina和Ion Torrent的Pattern Flow Cell同样采用了“正三角形矩阵排列”，图3左侧为NovaSeq Flow Cell的显微图像，右侧为illumina示意的后续升级方向。NovaSeq Flow Cell的簇密度为2961k/mm2，如果按照其幻灯片中宣称的“5X Increased density”，那么illumina 下一代新产品Flow Cell的簇密度可能会达到恐怖的“15000k～20000k/mm2”。

图4.Ion Torrent Ion 530 Chip 正三角形或称蜂巢式阵列

除了改变信号点的排列方式，根据华大智造的公开信息可知，DNBSEQ-G99的信号点Pitch也进一步缩小到了600nm的水平。信号点“Pitch缩小”和“三角形阵列排布”都可以显著提高测序芯片的信号密度，那么在目标数据产量要求不变的情况下（80～100M reads/Flow Cell），可正常识别的信号密度越高，相机需要采集的芯片面积就越小。相对应的每个测序循环中“信号采集时间”也会缩短。

表2.illumina、MGI华大智造pattern Flow Cell Pitch统计表

提高测序芯片的信号密度也是各大测序仪制造商降低测序成本的重要手段之一。但信号密度不断增加，如果超出了相机或检测器的检测能力也是不行的，所以DNBSEQ-G99本次也使用了“超分辨率物镜”，突破光学衍射极限，来实现高密度信号点的准确识别。

第2，快速的生化反应。测序循环时间（Cycle Time）主要由“生化流体时间”和“信号采集时间”构成。前面我们简单介绍了华大智造依托多种技术手段提高了测序芯片的有效信号密度，进而通过减小芯片面积来压缩“信号采集时间”。

在“生化流体时间”的压缩上，华大智造提到了其“生化孵育时间由分钟跨入秒级”以及“快速独特的补平方案”。华大智造测序产品的1个测序循环一般需要经历4个主要步骤：Hot dNTP（碱基标记了荧光基团且3‘-O-Block）聚合→Cold dNTP（未标记荧光基团且3‘-O-Block）聚合→荧光信号采集→荧光基团切除与Block切除。

华大智造特别提及的“快速独特的补平方案”对应的是“Cold dNTP聚合”这个步骤，这说明在DNBSEQ-G99 生化流体时间的压缩上，该环节可能做出了重要的贡献。

补充说明一下为何有“Cold dNTP聚合”这个步骤。如图5右侧所示，因为并不能保证Hot dNTP可以与DNA纳米球中所有结合了测序引物的拷贝发生聚合反应，而在本轮未发生聚合反应的拷贝则可能会在下一轮测序循环中产生滞后信号（Lag或称Phasing）进而增加测序噪音。所以Hot dNTP聚合反应完成后通入Cold dNTP来“充分补平”非常重要。而且通常情况下Cold dNTP补平的反应时间要长于Hot dNTP聚合的反应时间，如果可以“大大缩短补平反应时间”或者“直接去掉补平步骤（要求Hot dNTP的反应效率足够高）”将是压缩“生化流体时间板块”的有效手段。

第3，超快速的升降温。在一个测序循环中，Hot dNTP聚合→Cold dNTP聚合→荧光信号采集→荧光基团切除与Block切除，这4个主要步骤一般情况下需要在3个不同的温度下进行：Hot /Cold dNTP聚合反应所需的温度A、信号采集所需的温度B以及切除反应所需要的温度C。

这就需要测序仪的温控系统在A、B、C三个温度水平上快速完成切换，升降温速度提高确实可以进一步压缩测序循环时间。当然如果能够实现恒温化学最好，即切除、聚合与拍照均在同一个温度下进行。

以上即我们根据华大智造目前公开的信息简单分析了DNBSEQ-G99“快”的3点原因，后续我们将为大家讲解该产品更多的特点以及其可能依托的技术、原理。