高通量测序 | 病原宏基因组检测平台的建设以及质量保证

早期诊断是防控感染性疾病的关键，病原宏基因组高通量测序（mNGS）技术突破了传统的培养方法或靶向分子检测手段的局限性，利用鸟枪法高通量测序技术对临床标本中的微生物进行无偏倚的快速检测，提升了疑难、罕见感染性病原体的诊疗水平，目前已经得到了临床的广泛认可。mNGS检测流程复杂，目前尚无统一的规范和要求，而多数实验室在建立平台初期缺乏相关人才的储备，致使mNGS平台建设和质量控制面临严峻挑战。

本文从北京协和医院mNGS实验室本地化建设和运行过程中的实际经验出发，从建立mNGS实验室的硬件要求、mNGS检测体系的建立和评估方法以及mNGS临床应用后的质量保证三个方面进行概述，相对系统地介绍了mNGS检测平台和质量管理体系规范化建设和运行的建议。

近年来，随着越来越多的临床研究和专家共识的发表，病原宏基因组高通量测序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）技术在疑难、罕见感染性疾病诊断中的地位日益显著，许多医院希望实现本地化mNGS检测。相对于其他检测技术而言，mNGS技术门槛相对高，其对人员、场地、设备等有其特定的要求，然而目前缺少相关的文件指导医疗机构建设mNGS平台，间接导至各实验室间的检测结果异质性较高，对临床诊疗工作造成了一定干扰，mNGS的规范化临床应用道阻且长。

1. 场地要求：mNGS实验室的分区原则应遵循分子生物学实验室设计的一般规则，即“各区独立、注意风向、因地制宜、方便工作”^［1］。通常情况下，mNGS检测需要经过试剂配制、样本处理、核酸提取、文库构建、上机测序及数据分析与判读。根据实验过程又可以分为湿实验（标本操作流程）和干实验（数据分析流程）。为保证实验流程顺畅，建议使用相邻的房间进行设计，各实验区设置独立的缓冲区以避免二次污染。除了合理的空间布局外，合格的气压差（建议相邻实验室间、缓冲间和主实验区间压差5 Pa）和空气流向也是保证实验室有效通风，减少实验操作带来的气溶胶污染，保证检测质量的重要方面^［2］。与传统PCR技术的靶向检测基因片段不同，mNGS技术可对标本中的所有核酸片段进行无偏倚检测，样本间的交叉污染发生概率增加。因此，建议针对微生物丰度较高的标本类型（如粪便等），应单独设置标本处理区域或房间，平行检测阴性对照可监控高丰度标本对批次内其他标本的潜在交叉污染情况。

2. 设备要求：实验室应配备mNGS实验检测需求的仪器设备，通常包括但不限于高通量测序仪、服务器、超净台、生物安全柜、超纯水仪、超声波DNA打断仪、PCR分析仪、均质机、高通量测序自动建库仪等。为尽可能避免交叉污染，在标本连接标签序列之前的核酸提取和纯化等实验操作、DNA流程和RNA流程应在固定且不同的生物安全柜中操作。建议使用A2型半排型生物安全柜并定期校准，有条件的实验室建议配备B2全排型安全柜。对于关键仪器设备，例如测序仪和建库仪，应符合医疗器械的相关标准，优先选择使用获得国家药品监督管理局批准的仪器设备。为保证测序数据信息安全，mNGS的数据分析和存储建议在本地局域网内完成。因此，实验室应配备mNGS专用服务器，根据目前主流分析软件的运行需求，建议至少配制8核心处理器，内存不低于200 G^［3］。

3. 人员要求：mNGS工作主要分为“湿实验”和“干实验”两部分，其中“湿实验”部分操作复杂，操作不规范可引起同批次交叉污染或造成实验室环境污染^［4］。因此，“湿实验”人员除应具备临床基因扩增检验技术人员上岗证和检验技师资格证外，还应进行实验室内部培训和考核^［2］，鼓励实验室培养检验医师参与mNGS结果解读工作。不同的实验室NGS的预期临床用途存在差异，使用商品化试剂盒进行靶向NGS检测的实验室，数据分析和解读流程相对固定和统一；而对于非靶向mNGS检测的实验室而言，应配备搭建生物信息学分析的专业人员，同时数据分析和报告解读团队应由生物信息学、微生物学、临床医学等专业知识背景的工作人员组成，建议通过能力考核和评估后方可上岗^［2］，并定期进行能力评估。

4. 生物安全：mNGS检测的标本含有潜在感染性病原体，因此实验室建设时应参考相关生物安全法规和要求，例如《中华人民共和国生物安全法》《病原微生物实验室生物安全管理条例》《生物安全实验室建筑技术规范》《医学生物安全二级实验室建筑技术标准》《医学实验室安全要求》《实验室生物安全通用要求》《病原微生物实验室生物安全通用准则》。

临床应用之前，实验室应进行mNGS检测流程的性能确认或国家药品监督管理局批准的mNGS商品化试剂盒的性能验证，这是每个拟开展临床检测的实验室必须完成的工作之一。目前，国家药品监督管理局尚未批准相关商品化试剂盒，因此，拟开展mNGS检测的实验室应该按照实验自建试剂的要求进行试剂的性能确认和临床评价工作。

mNGS可检测的标本类型多样，覆盖病原种类可多达上万种，不同实验室使用的测序试剂、实验流程和仪器存在较大差异，这些因素均会影响检测结果。因此，在建立mNGS检测方法时应对不同影响因素综合考虑，并设计相应的实验方案以完成性能确认。mNGS检测体系的建立主要包括三个步骤：方法学建立、性能确认和标准操作作业书的建立。

方法学建立应以临床预期用途为出发点，确定相应的标本类型以及相对固定的病原种类，有针对性地设计性能评价方案，建立可符合临床需求的检测方法^［5］。其中主要包括生物信息学分析流程和湿实验流程的建立与评估。

1. 湿实验流程的建立与评估：mNGS湿实验流程一般包括标本前处理、核酸提取、去宿主（可选）、建库、混合文库等步骤。实验流程的每一个步骤都会对检测结果产生影响，对于自建方法的实验室来讲，需要考虑试剂是否可持续供应，避免部分试剂组分缺货而改变湿实验流程。

• 标本前处理过程：主要涉及标本的合格性评估、部分标本类型的液化、标本的分装、标本特异性外源性内标的添加（可选）。外源性内标的加入可以对实验的全流程进行监控，同时可作为病原相对定量的参考标准。

• 核酸提取过程：是导至mNGS结果存在差异的重要因素之一^［6］。目前的商品化病原体核酸提取试剂主要分为磁珠法和柱提法两种，通常在研发过程中以提取某一种或某一类病原体核酸为主要目的进行优化。对mNGS而言，理想的提取试剂应可无偏差地提取标本中所有病原体，因此从临床重点关注的病原体种类中，挑选代表性病原体制备模拟标本盘，评估核酸提取试剂的综合提取效率。同时，为尽可能降低背景核酸的复杂性，应对提取的核酸纯度进行评估。

• 去宿主流程：可以分为物理去宿主和化学去宿主两种方式。对于高宿主背景的标本而言，通过去宿主步骤可以起到富集病原体的作用，从而达到降低假阴性的目的。但是，额外增加的实验步骤有可能会造成低载量病原体的漏检^［6］。已有研究表明，标本的宿主细胞含量与提取核酸的浓度呈正相关^［7］。建议实验室根据标本的核酸浓度，推测所检测标本的宿主率决定是否进行去宿主处理。

• 建库：文库的质量直接关系到测序质量，mNGS的建库可以分为基于PCR的建库和PCR-free建库两种方式。虽然基于PCR的建库流程使用随机引物进行扩增，但不同的片段扩增效率可存在一定差异，文库中病原体基因片段的比例在建库过程中发生变化，导至文库与原始标本中基因片段的比例存在差异，进而影响临床报告的解读。建议制备病原体比例固定的核酸参考品，对建库试剂进行评估。

• 混合文库：目的是把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量进行混合后上机测序。混合文库前需要进行片段筛选和片段长度分布范围的测定。混合文库公式的设置应同时考虑片段分布特征和数据量，以尽可能减少偏差。

2. 生物信息学分析流程的建立与评估：mNGS的生物信息学分析主要包括数据库和分析流程两部分。

• 数据库：主要由3大部分组成，包括宿主基因组数据、病原微生物参考基因组数据库、耐药基因和毒力元件数据。目前的公共数据库中，部分微生物的基因组尚不完善，且部分基因组中含有人类基因组序列或其他物种基因组污染序列^［8］。因此，在数据库搭建过程中，需要对所下载的参考基因组进行过滤筛选，并进行质量评估后，方可作为参考基因组使用，同时应对基因组的代表性进行评估^［9］。目前，可对mNGS原始数据进行分析的软件有40余种。根据国家卫生健康委员会临床检验中心的室间质评数据，使用Burrow-Wheeler Aligner、Suite of Nucleotide Analysis Programs、Kraken或Bowtie的实验室数量占比超过75%^［10］。不同分析软件各有所长，其性能参数需要结合不同的数据库进行系统评估。但是，这些软件多为基于短序列比对的分析软件，可对数据库中包含的病原体进行诊断。对于新发未知病原体的诊断，建议建立基于组装算法的生物信息学分析流程。

• 生物信息学分析流程：其评估不同于常规的体外诊断试剂的评估，可参照计算机软件的评估要求，评估其准确率、召回率、精确率、平衡F分数；其次，结合临床拟检测的标本类型和病原范围，模拟极限情况下（宿主细胞浓度高、病原浓度低）的生物信息参考品以评估最低测序数据量^［5］。

  
  

1. 性能确认：由于目前实验室以自建mNGS检测方法开展临床检测，其检测系统的相关性能需要在实验室内部设计实验方案，明确相关性能，并完成临床评估。建议完成阳性判断阈值、最低检测限、精密度、抗干扰、交叉反应等性能评估^［5］。作为一种分子检测技术，部分性能，如最低检测限、精密度等可参考传统的靶向分子检测试剂的相关文件要求进行评估^［5］。但是，mNGS检测技术的背景核酸、阳性阈值、抗干扰能力等与其他的分子生物学技术存在显著不同，需要设计相应的实验方案进行评估^［5］。以阳性阈值为例，除了检测流程以外，标本类型和病原体类型均会影响病原体的阳性阈值^［11-13］。

2. 全流程的临床评估：主要包括阳性预测价值和阴性预测价值两个方面。应根据临床预期用途选择适当的患者人群，不宜使用健康人群的标本作为临床评估标本；临床阳性标本建议不低于50例。

由于mNGS与传统的分子生物学实验存在明显的差异，建议根据实际工作情况，建立独立的质量管理体系文件。完善的质量体系文件是保证实验室正常运转的有力保证，管理体系文件的架构一般从上到下分为质量手册、程序文件、作业指导书、记录表格4个层次。mNGS实验室的质量体系文件可包括：实验室组织结构与工作制度，标本采集、转运与保存要求文件，标准操作指导书，试剂和耗材的批间比对文件，背景核酸更新记录表，仪器设备的维护与校准记录表，实验记录文件及表格，室内质量控制记录文件，生物安全防护要求文件等，本文就各文件的要点进行概述。

1. 标本采集：应在保证生物安全的前提下，无菌操作条件下，按照特定标本的采集要求进行采集。标本采集文件应明确规定标本的采集容器要求、明确标本的采集量、明确标本采集后送到实验室检测所能容许的最大时间间隔等。此外标本运输条件应根据性能确认中样本稳定性数据进行制定，尽可能避免标本运输过程中反复冻融。

2. 标准操作指导书：应对实验室接收到标本至报告发放全流程的操作流程、仪器操作、分析流程和结果判读等流程和规则进行描述，同时需要对所使用流程的各方面性能进行说明。需要注意的是，mNGS的实验流程往往处于不断优化和评估中。当临床实践表明优化的流程确实可靠后，方可修改标准操作指导书。

3. 试剂和耗材的批间比对文件：根据北京协和医院本地实验室运行情况，mNGS试剂或耗材批次更换会显著影响背景核酸，进而需要根据新批次试剂耗材的背景核酸情况适当调整部分病原体的阳性判定阈值，因此试剂和耗材批次更换前需要进行批间比对，并记录背景核酸的变化情况。

4. 仪器设备的维护与校准记录表：mNGS检测过程中使用的仪器众多，包括生物安全柜、PCR仪器、自动建库仪、高通量测序仪等均需要定期校准，其中高通量测序仪的校准至少需要完成测序准确率和重复性的评估，并定期对管路压力进行评估和记录。

5. mNGS实验记录文件和表格：需要对实验过程进行准确记录，主要包括提取浓度与纯度、出库浓度、文库片段分布、下机总数据量、测序质量（Q20、Q30比率）、阴阳性质控等^［14］。

6. 生物安全防护要求文件：实验室的生物安全涉及多个方面，包括人员培训与管理、环境与设备管理、未检测标本的转运与已检测标本和医疗废弃物的处理、标本溢洒应急预案等。

mNGS临床应用后，为保证临床检测结果准确，需要制定相应的管理要求。一般来讲，可从室内质量控制、室间质量评价、流程持续研发更新制度三个方面来保证检测质量。

对于mNGS而言，室内质量控制主要包括检测前标本质量的评估、检测中质控情况、检测后数据分析和报告解读三个大的方面。

1. 检测前标本质量的评估：合格的临床标本是保证检测结果准确的重要基础，临床中常见的不合格标本原因主要有标本量不足、送检时间或条件不达标、容器错误以及条码错误等，实验室应定期回顾性分析不合格标本原因和占比，积极进行临床沟通并提出相应的预防措施^［15］。此外，采集感染部位相应的标本可提高阳性检出率^［14-16］。

2. 检测中质控情况：标本检测过程中需要及时准确地填写实验记录表，分别监控核酸提取、文库构建、测序等过程。此外，mNGS的质控与传统的分子生物学一样，每批次实验均应检测阳性质控、阴性质控，同时建议加入外源性内标。阳性质控和阴性质控的基质应尽可能与临床标本保持一致，阳性质控中病原体种类尽可能覆盖细菌、真菌、病毒等多个类别，病原体的浓度与宿主细胞浓度范围和比值应参考临床阳性标本进行设置，阳性质控的浓度应控制在最低检测限的2~3倍为宜。阳性质控使用前应至少进行均匀性和稳定性评估，形成验证文件，并在使用过程中记录每批次阳性质控的检出情况。建议使用既往检测为阴性的标本作为阴性质控。建议使用去离子水或生理盐水作为空白对照，其可帮助监控实验室背景核酸的变化并及时发现实验室污染，建议试剂批次更换、季节更替或解读人员发现背景核酸发生显著变化时检测。

3. 检测后数据分析和报告解读：mNGS的数据分析和报告解读是目前临床应用的难点之一，主要体现在分析流程无统一的规范和要求^［17］，解读人才相对短缺，随着越来越多的专家共识推出，相信这一问题会逐步得到解决^［18］。同时，有条件的医院可建立“临床微生物测序委员会”，报告解读由实验室工作人员、感染病专家和主管医师共同参与，有助于在临床背景下更加精准地确定责任病原体^［19］。

室间质量评价是用来评估实验室运行状况的主要方式，建议常规参加国家或省市级的室间质评^［2］。实验室可根据室间质评结果及时发现实验流程的相关问题，并及时进行优化。但是作者团队也注意到，目前各组织机构组织的室间质评项目所包含的病原体种类和标本类型相对局限^{［10，20-21］}，对全方位反映mNGS实验室实际的运行状况仍有不足。实验室可根据自身需求，除了参加室间质评外，也可定期与其他实验室以室间比对的方式完成更多标本类型和病原体的检测性能评价。

在mNGS临床应用过程中，感染性疾病的病原谱会随时间推移而发生变化，例如2022年发现感染人类的琅琊病毒^［22］。此外，分析软件和算法也会迭代更新，部分病原体的代表性基因组也会被全球的研究者不断更新和完善。因此，实验室应及时应对以上变化，并及时优化实验室使用的核酸提取流程和数据分析流程，并进行充分的性能评估后方可应用于临床检测^［23-24］。

目前，mNGS正迅速地从科学研究转化到医学实验室。与传统的分子检测技术或微生物培养技术相比，mNGS展现了特殊优势，但是任何技术都不能解决所有的临床问题，加之mNGS技术本身存在诸多不完善的环节。比如，如何保证不同标本类型中不同病原体的核酸提取效率，去宿主方式的选择，真菌和病毒数据库的完整性等因素均需要进一步技术研发和优化。此外，国家监管政策、入院政策仍在修订中，目前其临床应用仍然处于探索阶段，如何规范其临床应用已成为近两年的重要议题之一。本文就北京协和医院mNGS平台的建设经验进行概述，不足之处请各位同行批评指正，共同探索更加科学合理的mNGS平台建设与质量保证之路。

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