文章来源：《中国防痨杂志》网络首发论文 作者：梁建琴，吴雪琼，安慧茹 DOI：10.19982/j.issn.1000-6621.20230113
摘要 核酸基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization–time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）技术在结核病与非结核分枝杆菌病病原学和耐药性诊断中的应用越来越多，为早期诊断、鉴别诊断和耐药鉴定提供了快速、准确的依据。然而，在实际应用中，临床医生对标本的选择、留取、送检时机及注意事项、报告结果的解读等的理解和掌握参差不齐，尚需规范化。本共识总结了核酸MALDI-TOF MS检测技术应用于结核病和非结核分枝杆菌病诊断的临床适应证和标本采集注意事项，介绍了如何正确解读核酸MALDI-TOF MS技术鉴定分枝杆菌菌种和耐药性的报告结果，以进一步规范核酸MALDI-TOF MS技术在结核病和非结核分枝杆菌病诊断中的临床应用，提高临床诊断水平，指导临床开展早期精准有效的治疗。 第一部分 核酸基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术 基本原理与特点
第二部分 共识制定的过程 第三部分 核酸MALDI-TOF MS技术鉴定分枝杆菌菌种 及其耐药性 目前，核酸MALDI-TOF MS技术可鉴定结核分枝杆菌复合群8个亚种和40个NTM菌种及其亚种，合计48个分枝杆菌菌种和亚种（表2），几乎覆盖了临床上分枝杆菌病的所有常见致病菌，可以满足临床实现快速鉴定分枝杆菌菌种的要求，为临床医务人员提供诊断参考。另外，随着临床实践的逐步积累，核酸MALDI-TOF MS技术可根据临床上未来可能出现的菌种予以增加鉴定。
第四部分 应用核酸 MALDI-TOF MS 技术检测分枝杆菌病 的临床适应证和送检时机
推荐意见1：近期具有明确的肺结核密切接触史，咳嗽、咳痰超过2周，伴或不伴有咯血、胸痛、胸闷、气短等呼吸道症状和低热、盗汗、乏力、体质量减轻等全身中毒症状，临床常用结核病病原学检查结果为阴性，影像学检查存在肺部病变，需快速确诊的患者，建议送痰和支气管肺泡灌洗液进行培养的同时送核酸MALDI-TOF MS检测，可在1～2 d内快速鉴定病原菌以明确诊断。 推荐意见2：胸部影像学表现高度怀疑肺结核，γ-干扰素释放试验（interferon-gamma release assays，IGRA）阳性，结核菌素皮肤试验（tuberculin skin test，TST）强阳性或重组结核杆菌融合蛋白（EC；宜卡®）阳性，临床常用病原学检测阴性，诊断性抗结核治疗效果差，适合送MALDI-TOF MS检测，可快速明确诊断。 推荐意见3：疑似结核性胸膜炎患者，胸腔积液常规结核分枝杆菌细菌学检查阳性率低，建议按要求送胸腔积液进行核酸MALDI-TOF MS检测以提高病原学检出率。 推荐意见4：疑似肺外结核，如结核性脑膜炎、结核性淋巴结炎、骨关节结核、肠结核、结核性腹膜炎、泌尿生殖系统结核、结核性心包炎、皮肤结核等肺外结核患者，治疗效果差，分泌物和（或）活检、手术组织临床常用病原学检测阴性时，适合送核酸MALDI-TOF MS检测。 推荐意见5：胸部影像学表现高度疑似NTM肺病，尤其是IGRA阴性和EC皮肤试验阴性，TST阳性者，适合及早送痰和（或）支气管肺泡灌洗液进行核酸MALDI-TOF MS检测。 推荐意见6：慢性肺部疾病，包括肺囊性纤维化、支气管扩张、慢性阻塞性肺疾病、尘肺、肺间质纤维化、支气管哮喘、过敏性肺炎、变应性支气管肺曲霉菌病等患者，经规范性治疗效果差，尤其合并免疫功能受损，如艾滋病病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染/艾滋病（acquired immune deficiency syndrome，AIDS）和器官移植等长期服用免疫抑制剂的患者，高度怀疑并发肺结核或NTM肺病时，适合送核酸MALDI-TOF MS，以快速鉴定病原菌及其耐药性。 推荐意见7：对外伤或手术，包括医疗美容手术后出现局部皮肤反复感染，伤口经久不愈的患者，建议送伤口分泌物进行核酸MALDI-TOF MS，排除NTM感染。 推荐意见8：确诊NTM病，包括NTM肺病和肺外NTM病的患者，需要明确感染菌种对药物的敏感性，可进行核酸MALDI-TOF MS检测。 推荐意见9：复治肺结核和肺外结核，抗结核药物治疗效果不佳或者病情复发，高度怀疑耐药的患者，进行痰、分泌物、活检及手术组织表型和基因型药敏试验的同时，可送核酸MALDI-TOF MS进行耐药性检测；高度怀疑异质性耐药者，可在治疗过程中进行核酸MALDI-TOF MS耐药性检测跟踪。 推荐意见10：肺结核和肺外结核诊断明确，痰、分泌物和（或）活检、手术组织GeneXpert MTB/RIF检测利福平耐药的患者，建议送核酸MALDI-TOF MS检测结核分枝杆菌对其他一线和二线抗结核药物的耐药性。 推荐意见11：对于鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌和脓肿分枝杆菌等致病性NTM，建议送核酸MALDI-TOF MS进行耐药性检测；对于弱致病性的NTM，可根据送检样本来源、临床症状和影像学表现，决定是否进行核酸MALDI-TOF MS检测其耐药性。 第五部分 标本的采集、运输、检测及实验室质量控制、 出具报告 1.采集标本容器：收集临床标本的容器内需含有分枝杆菌灭活剂成分。 2.采集标本信息：收集标本的容器上应标注患者信息、标本类型、送检科室等信息。送检标本应有送检申请表，填写受检者信息，包括编码、采样日期、个人基本信息、标本类型、采样单位等。采样人员在采样前及采样后均需仔细核对受检者信息。 4.采集标本时：不同类型的生物标本采集，必须由经过培训且考核合格的专业人员进行规范操作，严格执行无菌操作，避免标本污染；对高度怀疑分枝杆菌病者，建议送检2份以上同类型或不同类型的样本；其他肺外结核样本最好采集自病灶处；呼吸道样本采集必须采取适当的感染控制预防措施，包括个人防护措施等。 5.采集标本后：采集后的样本应该在24 h内进行灭活保存处理。 推荐意见12：生物标本采集必须由专业人员执行，采取适当的感染控制措施；收集标本的专用容器上应注明患者及标本的详细信息；对高度怀疑分枝杆菌病者，建议采集2份以上同类型或不同类型的样本；采集后的样本应该立即送检，否则须放在4℃冰箱暂存且在24 h内进行灭活处理。 1. 痰液：需3～5 ml。最好采集清晨痰或夜间痰。合格的痰标本应是患者深呼吸后，由肺部深处咳出的分泌物，包括干酪痰、血痰、黏液痰，唾液或口水为不合格痰标本。对于不合格痰标本，应重新采集。但若患者无法自行咳痰或者无痰、少痰，可通过诱导（浓氯化钠溶液雾化诱导排痰）获得深部痰，也可通过吸痰器从气道采集。采集样本后应立即送检，实验室收到样本后应即刻进行质量检查和处理等，如不能立即检查，应暂放在4℃冰箱且在24 h内进行灭活保存处理。 2. 支气管肺泡灌洗液：需>15 ml。通过纤维支气管镜接近病灶处，用等渗氯化钠溶液分次注入，立即负压吸引回收，弃去首次灌洗液，以减少污染。收集2～3次回收的支气管肺泡灌洗液至少15 ml送检。如果回收的支气管肺泡灌洗液超过15 ml，将支气管肺泡灌洗液放在桌面上静置沉淀片刻后，留取15 ml下层液体，在密封状态下摇匀后，转移至采样管中，以封口膜密封管口，装入密封袋中送检。若灌洗液没有及时转移到采样管，须放在4℃冰箱暂存且在24 h内进行灭活保存处理。 3. 积液型样本：比如胸腔积液、腹腔积液、心包积液、关节腔积液等样本的留取量及处理方法同支气管肺泡灌洗液。 4. 尿液：需50 ml。留取尿液样本前一晚尽量少饮水，取清洁容器收集清晨第一次全部尿液或24 h尿液沉淀。 5. 粪便：需取体积至少为黄豆粒大小的新鲜粪便，或者稀便至少为3～5 ml。 6. 组织类样本：需取体积至少为5 mm3的新鲜或石蜡包埋的组织标本。 7. 其他类型样本：脑脊液样本需留取至少5 ml；脓液需留取1～2 ml；咽拭子和分泌物拭子需留取2份拭子。 推荐意见13：不同类型的临床生物标本采集量不同。采集液体类标本应静置，取下层沉淀物至采样管中，装入密封袋中送检；对于固体标本和组织类标本，最好采集新鲜病灶处样本立即送检，必要时可采集石蜡包埋的组织标本进行进一步检测。 推荐意见14：标本的运输和保存需遵循生物安全管理规定，符合安全要求。妥善保存未用完的核酸样本或者临床标本，建议根据生物样本管理方法命名并保存样本，以便于未来追溯。 3. PCR反应和延伸反应：多重聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）后进行虾碱性磷酸酶（shrimp alkaline phosphatase，SAP）反应，产物延伸后进行脱盐处理。 4. 质谱分析：采用纳米分配器将以上PCR产物点在金属板芯片上，放入飞行时间质谱仪进行检测和分析。实验室应安排专门的医学人员对耐药基因每个变异进行人工审核，后期需定期统计分析检测效率、准确性并进行及时的优化与更新。根据最新的研究信息和我国的耐药基因特点，进行耐药基因和耐药位点的补充和调整。 推荐意见15：样本前处理、核酸提取、PCR反应和质谱分析，每一步都需要进行质量检验，PCR反应和质谱分析需要设置阴性对照和阳性对照。要定期进行室内质量控制和室间质量控制。 推荐意见16：病原检测报告信息必须完整准确，尤其要对患者信息、检测标本、检测参数进行严格审核才能出具报告；在出具耐药检测结果时，应指出相应耐药水平程度，以更好地指导临床医生用药。 第六部分 临床结果判读 推荐意见17：对于呼吸道样本，核酸MALDI-TOF MS检测结果为结核分枝杆菌阳性者，可进一步参考《WS 288—2017肺结核诊断》[50]做出综合判断。对于经核酸MALDI-TOF MS检测为阴性而临床高度怀疑结核病者，可根据患者意愿，再次送样本进行核酸MALDI-TOF MS检测，以提高检出率。 推荐意见18：对于非呼吸道标本，如脑脊液、胸腔积液、心包积液等各种体液样本，核酸MALDI-TOF MS检测结果为结核分枝杆菌阳性，则具有较好的临床诊断价值，优先考虑肺外结核的可能。 推荐意见 19：对于鉴定为结核分枝杆菌复合群感染的患者，进一步进行一线和二线抗结核药物的耐药性检测，可实现快速诊断的目的，尽早提供精准的个体化治疗方案，有利于控制结核分枝杆菌尤其是耐药结核分枝杆菌的进一步传播 推荐意见20：针对痰液样本，建议送检2次分开采集的样本，结果为同一种NTM菌种才能做出诊断。 推荐意见21：针对支气管肺泡灌洗液样本，结果为阳性即可做出诊断。不同临床样本所得到的结果，其临床意义有所不同，来自血液、淋巴结、骨髓、肝脏、肾脏等非开放无菌来源的样本检出NTM往往意味着致病菌，而呼吸道、尿液样本检出的NTM，需要排除污染或定植菌的可能。 2. 异烟肼：异烟肼耐药突变主要集中在katG、inhA和oxyRC-ahpC操纵子。katG基因突变占临床耐药菌株的50%～70%，inhA基因突变占临床耐药菌株的10%～35%[55,56]。目前，应用核酸MALDI-TOF MS技术可检测katG和inhA基因的常见突变位点，能很好地预测异烟肼耐药，与临床耐药存在较高的一致性。对于异烟肼耐药结核病，可根据检测到的突变基因型选择用药，当仅检测到inhA突变时，考虑为INH低水平耐药，可以综合考虑加大异烟肼剂量，而当检测到katG突变时，考虑为INH中、高水平耐药，建议停用异烟肼[57,58]。检测报告中予以相应提示，供临床医生参考。 3. 乙胺丁醇：乙胺丁醇耐药突变主要发生于embB基因。编码1098个氨基酸的阿拉伯糖基转移酶，涉及到的耐药位点包括306位密码子ATG和406位密码子GGC，可检测70%以上的乙胺丁醇耐药。临床上，embB的306和406位点的一些突变也出现在乙胺丁醇敏感型菌株中，这可能是临床表型药敏试验检测结果存在不稳定性、可重复性差所导至的[59,60]。WHO不推荐乙胺丁醇进行表型药敏试验检测[61]。 4. 吡嗪酰胺：吡嗪酰胺耐药突变主要集中在pncA基因，占临床耐药菌株的72%～98%。吡嗪酰胺的耐药位点较为特殊，几乎平均分布于pncA整个基因上，pncA全长561 bp，有60多个突变位点，耐药类型多样，包括突变（约43个）、插入（约7个）和缺失（约12个），有些位点已被证实与耐药无关[62]。临床表型药敏试验存在可重复性差的问题。研究发现，pncA57CAC和pncA启动子区域A-11G是较为常见的耐药突变位点[42]。如果核酸MALDI-TOF MS检测到突变，提示该菌株很可能存在吡嗪酰胺耐药；如果没有检测到突变，可结合临床治疗效果综合判定，也可进一步对pncA基因进行基因测序加以确认。 5. 氟喹诺酮类药物：氟喹诺酮类耐药突变主要集中在gyrA和gyrB基因。应用核酸MALDI-TOF MS可检测gyrA基因绝大多数耐药位点，以及gyrB基因上的常见耐药位点，能很好地预测氟喹诺酮类耐药，与临床表型耐药具有较高的一致性。若检测到gyrAA90V突变，大剂量的莫西沙星仍有一定的杀菌活性[63]。根据人群药代动力学模型提示，引起低水平耐药的基因突变菌株，如gyrAA90V突变，加大莫西沙星剂量仍可以发挥治疗效果，但是加大左氧氟沙星和氧氟沙星剂量无效；而引起高水平耐药的基因突变菌株，如gyrA的G88C、D94N和D94G突变，加大任意一种氟喹诺酮类药物均无效[64]。检测报告中可提示“供临床医生参考”。 6. 乙硫异烟胺/丙硫异烟胺：乙硫异烟胺/丙硫异烟胺的耐药突变主要集中在inhA启动子区域和ethA基因。inhA基因启动子区域，涉及到的位点同异烟肼；ethA基因耐药位点散在分布[65]。研究表明，如果设计增加ethA基因，虽然可增加乙硫异烟胺/丙硫异烟胺的耐药检测敏感度，但特异度下降[66]。另外，乙硫异烟胺/丙硫异烟胺的表型药敏试验检测缺乏充分的可重复性，与基因型药敏试验结果一致性较差，故目前核酸MALDI-TOF MS技术并未用于检测ethA基因的耐药位点。如果MALDI-TOF MS检测到inhA启动子突变，提示该菌株很可能存在耐药，而且乙硫异烟胺/丙硫异烟胺的耐药水平高[42]；而表型药敏试验检测结果若为敏感，可结合病原学检查综合判读，也可考虑重复实验或用其他方法检测。 7. 贝达喹啉/氯法齐明：这两种药物的耐药突变主要发生于mmpR(Rv0678)，该基因突变往往导至结核分枝杆菌对贝达喹啉和氯法齐明的外排增多，导至氯法齐明耐药和贝达喹啉部分耐药。贝达喹啉在耐药结核病中的耐药率较低，根据已有报道，在1.0%～7.16%之间[43,67,68]，其耐药机制复杂，涉及几个基因（mmpR、atpE、pepQ和Rv1979）的多种突变，临床最为流行的是mmpR基因突变，atpE突变只占小部分。来自重庆的一项研究显示，贝达喹啉耐药菌株只发现mmpR突变，其余的耐药菌株未找到相关已知基因的突变[68]，因此存在其他机制导至贝达喹啉耐药，预测耐药效果不佳。氯法齐明在耐药结核病中的耐药率约为6.65%[43]，耐药相关基因有mmpR、Rv1979c、Rv2535c和Rv1453，其中mmpR突变是导至氯法齐明耐药的主要机制[69]，同样存在未鉴定的机制导至氯法齐明耐药，预测耐药效果不佳。目前，应用核酸MALDI-TOF MS检测mmpR(Rv0678)基因193G和466C位点突变与临床耐药高度一致。其中，贝达喹啉作为耐药结核病治疗方案中的A组药物，建议对耐药结核病患者尽早进行贝达喹啉的耐药性检测，若为敏感，应尽早使用贝达喹啉，可减少利福平耐药结核病/耐多药结核病的相关死亡和治疗失败率[70]。氯法齐明作为耐药结核病治疗方案中的B组药物，建议在决定使用该药治疗之前进行药敏检测以防止用药不当产生的不良反应[71]。 8. 利奈唑胺：利奈唑胺耐药突变主要发生在rplC，应用核酸MALDI-TOF MS可检测常见突变位点，与临床耐药高度一致。利奈唑胺在耐多药结核病中的耐药率约为3.84%[43]。如果发生rplC基因突变，MIC通常增加4～32倍。若检测到突变，提示该菌对利奈唑胺极大可能是耐药的，与治疗失败相关，目前可预测约75%的表型耐药临床株[72]。对于耐药结核病，尤其是准广泛耐药结核病（pre-extensive drug-resistant tuberculosis，Pre-XDR-TB）患者，接受利奈唑胺治疗的效果比未接受利奈唑胺治疗的效果好[73]。 9. 环丝氨酸：目前对于环丝氨酸的临床临界浓度没有统一的标准。我国研究者通过对100多例临床菌株进行最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentrations，MIC）分析和全基因组测序分析相关耐药基因突变，提出BACTEC MGIT 960体系中的流行病学临界浓度为16 mg/L[74]。大部分环丝氨酸耐药的临床菌株集中在alr和ald基因。WHO的耐药突变基因目录中尚未纳入环丝氨酸的耐药基因，同时WHO也不推荐对环丝氨酸进行常规表型药敏试验检测。目前，应用核酸MALDI-TOF MS检测alr和ald基因上的常见耐药位点用于预测环丝氨酸耐药性，会存在一部分漏检。若检测到突变，提示该菌株对环丝氨酸耐药的可能性极大。 10. 对氨基水杨酸钠：对氨基水杨酸钠耐药突变主要发生在folC和thyA，临床上以folC占多数。WHO的耐药突变基因目录中尚未纳入对氨基水杨酸钠的耐药基因，同时也不推荐对其进行常规表型药敏试验检测。目前，根据我国研究者发表的临床数据[75,76]，应用核酸MALDI-TOF MS检测folC和thyA两个基因的常见突变位点用于预测对氨基水杨酸钠的耐药性，会存在一部分漏检。若检测到突变，提示该菌株对对氨基水杨酸钠耐药的可能性极大。 11. 注射类药物（链霉素、卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素）：链霉素耐药突变主要集中在rpsL基因，占临床耐药菌株的80%；还有少数突变发生于rrs基因。目前，应用核酸MALDI-TOF MS检测rpsL43位和88位密码子，与临床耐药性有很好的一致性，若检测到突变，则提示该菌很可能对链霉素高水平耐药[42]；阿米卡星耐药突变主要集中在rrs基因，占临床耐药菌株的85%以上，通过核酸MALDI-TOF MS检测rrs的两个位点（1401、1484），与临床耐药的一致性高；卡那霉素耐药突变主要集中在rrs和eis启动子区域，通过核酸MALDI-TOF MS检测rrs的3个位点（1401、1402、1484）和eis启动子区位点与临床耐药高度一致；卷曲霉素耐药突变也主要是rrs，通过核酸MALDI-TOF MS检测rrs的3个位点（1401、1402、1484）与临床耐药高度一致，若检测到突变，则提示该菌很可能对卷曲霉素耐药。 推荐意见22：对于确定的结核分枝杆菌感染者，建议送核酸MALDI-TOF MS检测上述几种常见药物的耐药性，以提供快速而全面的预测判断，尽早给予个体化精准治疗。其中，一线抗结核药物利福平和异烟肼的耐药基因突变检测可很好地预测耐药性。其他大部分药物也可检出绝大部分临床常见耐药突变类型，可以较好地预测耐药性。 推荐意见23：对于强烈怀疑对吡嗪酰胺耐药的菌株，不推荐送核酸MALDI-TOF MS检测，必要时可以对整个pncA基因进行测序分析。 推荐意见24：对于怀疑对氟喹诺酮类药物耐药的菌株，可以送核酸MALDI-TOF MS检测，若检出耐药基因突变，很可能该菌株对氟喹诺酮类药物耐药；如果未检测到突变，也不能排除耐药的可能性。 2. 氨基糖苷类（阿米卡星、卡那霉素和庆大霉素）：NTM对这类药物的耐药突变主要集中在rrs基因，目前，应用核酸MALDI-TOF MS检测rrs1406、1408和1409位碱基突变与临床耐药高度一致[80]。若未检测到突变，提示这些药物可以治疗大环内酯类耐药的鸟分枝杆菌复合群肺病，建议使用吸入式阿米卡星治疗严重或对大环内酯类耐药的鸟分枝杆菌复合群肺病。 推荐意见25：对于检测出鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、脓肿分枝杆菌各亚种、堪萨斯分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌等跟临床疾病密切相关的NTM，建议送核酸MALDI-TOF MS检测大环内酯类和氨基糖苷类药物的耐药性。 推荐意见26：对于检测出弱致病性的与临床疾病不相关的NTM，可根据临床症状和影像学表现决定是否送核酸MALDI-TOF MS检测其耐药性。 推荐意见27：核酸MALDI-TOF MS检测可发现异质性耐药和同义突变，应结合临床治疗效果及时调整药物，优化治疗方案，提高诊治水平。 第七部分 总结 执笔者 梁建琴 吴雪琼 安慧茹 文章来源：《中国防痨杂志》网络首发论文 排版：康黎医学 作者：梁建琴，吴雪琼，安慧茹 DOI：10.19982/j.issn.1000-6621.20230113 |
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