微流控数字PCR芯片综述

前言

数字PCR技术属于一种精准诊断技术，其检测水平可以达到单个核酸分子水平，微流控技术和数字PCR技术的交叉应用技术主流的是两类，分别是基于微腔式实现分子隔离和液滴法实现分子隔离，这两种主流技术平台，在单分子免疫检测和单细胞测序上都是一样的。本篇小钱主要借参考文献[1]的内容给大家分享关于微流控技术和数字PCR的交叉应用技术知识，包括微流控数字PCR芯片的技术原理、技术平台、商业化、应用方向、总结和展望。

学习目录

2.1 基于液滴打印技术的微流控芯片数字PCR

4. 总结与展望

2. 基于微流控的数字PCR的技术发展

数字PCR技术的关键是高效地生成独立的微反应器，商业化的数字PCR系统通常需要专门制造复杂的芯片，或者需要对微阀和泵进行专门的外部控制以生成离散液滴，以及需要用于信号读取的专业测试设备。尽管其稳定性高，但面临调节液滴体积和梯度的灵活性较差、设备成本高等问题。目前基于微流控的数字PCR有很多实现方式，例如基于液滴打印技术的微流控芯片数字PCR、基于多层微流控芯片的数字PCR、基于微珠的微流控数字PCR等[1]。

2.1 基于液滴打印技术的微流控芯片数字PCR

图1：微流控打印液滴数字PCR装置（MIP-ddPCR装置）的示意图，该装置由（a）微流控打印机，（b）平板热循环仪和（c）荧光显微镜组成。（d）一次性微流控打印芯片的制造过程和（e）疏水性石英基板的制造过程的示意图[2]。

如图1，Y.Pan等人研究了一种新的数字微滴PCR技术，该技术通过带有一次性微流控芯片的微流控冲击打印机(MIP)将遗传目标划分为平面纳升液滴阵列。纳升液滴阵列广泛分布在均匀的疏水石英基板上，然后使用平面热循环仪扩增分散在平面液滴阵列中的基因，并使用扫描荧光显微镜进行检测。此外,微流控冲击打印技术能够将多个液滴分配到任意位置，形成多体积液滴PCR系统，扩大了测量的浓度范围，可以准确检测到4个数量级的DNA模板。作为一种产生皮升至纳升液滴的非接触和无交叉污染的方法，MIP-ddPCR不需要其他数字PCR方法通常采用的外部泵和阀门，并且对昂贵的生物试剂具有很高的利用率(>92.6%)，特别适用于稀有生物靶标的检测。此外，该方法可以通过检测癌症标志物来区分癌症和正常组织，例如通过MIP-ddPCR对结肠癌组织中的p53基因进行绝对定量检测，证实了其临床应用潜力[1]。

2.2 基于PDMS的微流控数字PCR

在用于细胞捕捉、电化学、可穿戴、器官芯片等的微流控中常采用聚二甲基硅氧烷(polydime-thylsiloxane,PDMS)。在105℃烘箱数小时后，PDMS就会逐渐恢复疏水性，这样就能保证水包油液滴生成过程的稳定性。相比而言,硅片加工复杂，刻蚀成本高，其不透光的特性也限制了大部分需要观察的应用。PDMS优异的特性使其广泛用于微流控芯片[1]。

基于微流控的数字PCR平台根据分区格式可大致分为两类：液滴ddP CR和物理分区dPCR(pdPCR)。在ddPCR平台中，液滴是单分散且自由移动的，水溶液被离散化为数十万个油包水乳液，在实验过程中可能会引起碰撞和聚集，从而影响定量结果的准确性。相，在pdPCR平台中，采用微流控阵列物理隔离皮升至纳升大小的液体以进行数字化，试剂被分隔在等体积的固定结构的隔离室或微孔中，具有更高的分隔均匀性，并避免了液滴的聚集[1]。

图2：带缓冲室的自引式dPCR芯片示意图。(A) dPCR芯片结构设计原理图。芯片包含两种不同体积和形状的腔室。芯片只有一个入口，没有任何出口。主通道垂直分为多个分支，逐级划分。每个分支的末端连接6个反应室和1个缓冲室。(B) dPCR芯片的层状结构示意图，由两层玻璃盖玻片和夹在它们之间的PDMS(入口层和微阵列层)组成。(C) dPCR芯片原型的照片。该芯片包含两个面板，每个面板有3072个反应室和512个缓冲室。芯片的尺寸为20mm × 35mm[3]。

此外，pdPCR可以更轻松地在荧光显微镜下实时获得视觉扩增结果。如图2，G.W.Xu等人研发了一种基于PDMS的带缓冲室的自吸微流控芯片，用于稳健且易于操作的dP CR。该芯片只有一个入口，可以通过负压自主分配样品，该负压由具有多级垂直分支微通道的脱气PDMS层提供。将垂直分支微通道的每一端引入缓冲室，缓冲室使芯片能够非常稳健地分配样品。通过缓冲室和多级垂直分支微通道，该微流控芯片大大提高了dPCR芯片的耐受性，并且无需额外的泵和阀门即可主动实现试剂分隔。使用红色染料验证了该芯片的自分区结果，使用荧光染料验证了芯片缓冲室的缓冲效果。该微流控芯片可对10倍连续稀释的DNA模板进行定量检测,在靶基因的绝对定量检测方面表现出优异的性能[1]。

但是ddPCR和pdPCR都仅限于一步反应，其中所有试剂都在芯片外混合，并加载到微流控装置中进行一步反应，之后不允许添加额外的试剂。然而，许多生物检测需要多步骤和多试剂添加。例如，单细胞逆转录(RT)-PCR需要将裂解缓冲液、RT和PCR试剂多步加载到数字单元中进行转录分析。J.M.Hu等人开发了一种基于PDMS膜的易于使用的高密度微流控装置,用于执行多步骤、多试剂分析，如图3。

图3：多步进样芯片设计及工作原理。(A)我们的多层PDMS器件是由一个吸层，一个薄PDMS膜，一个微阵列层和一个玻璃盖玻片组装而成。所述吸力层具有具有微柱阵列以防止所述腔塌陷的大腔。该微阵列由12级分叉通道和4096个终端微室组成。(B)吸引层上的四个入口连接到外部真空以在微阵列内产生长期负压并因此促进样品加载过程。该设备的大小约为45毫米× 40毫米。(C)基于微阵列的多级分叉结构，通过在每个步骤中向芯片中引入分数体积的样品，直到所有微室被完全填充，实现了多步骤和多试剂加载[3]。

2.3 基于多层微流控芯片的数字PCR

现有的pdPCR平台均具有单层结构，并且这些芯片的总反应量较低，而这些微流控芯片可以通过增加芯片尺寸来产生更多的液滴，这将不得不牺牲dPCR扩增过程中的通量，因此增加相同芯片面积内的总反应体积和分区数量是一个巨大的挑战。研究表明，dPCR的灵敏度取决于反应的总体积，这取决于分区的数量及其体积。在一些领域，尤其是RNA定量检测低病毒载量时，dPCR不如qPCR敏感，这归因于较小的总反应体积。受多层印刷电路板(PCB)和集成电路(IC)封装的启发，如图4，G.W.Xu等人研制了一种用于数字PCR的双层微流控芯片[1]。

图4：双层微流控芯片。（A）分层芯片结构示意图。（B）微流控数字PCR（dPCR）芯片示意图。（C）芯片细节图。（D） 原型设备的照片。芯片尺寸为 35 毫米× 20 毫米[4]。

2.4 基于微珠的微流控数字PCR

基于微流控的dPCR是一种用于量化DNA靶标的高灵敏度分析技术。在微流控微孔阵列中进行分析之前，将目标序列捕获到微珠上进行预浓缩和样品净化，可以进一步提高检测灵敏度。但是制作直径≤3μm的微孔具有挑战性，并且孔的大小相对表面积使PCR容易受到设备加工过程中使用材料的影响。

如图5，B.F.M.Riley等人建立了一种新的微细加工程序，用来为基于微珠的dPCR创建超低容量 (100 fL ) 孔，该程序创建原始微流控阵列，使用双重工艺去除正抗蚀剂，并完全放弃使用负抗蚀剂,从而实现与理论预测匹配的数字信号的稳健放大，使原始设备表现出强大的dPCR扩增能力。通过量化设备内和设备间的异质性，表明微加工过程显著影响微流控微孔阵列中基于微珠的dPCR测定的精度。这项工作的结果表明了设备处理对下游分析性能的影响，有助于提高基于微珠的dP CR测定在未来生物学研究中的可重复性[1]。

目前，核酸信号放大策略还停留在基于标准曲线的相对定量阶段，而模板放大策略则是在单分子分析时代发展起来的。dPCR将反应体系划分为数千至数百万个微反应单元，进行单分子PCR。然后,使用探针检测扩增产物中的特定序列。H.P.Wu等人研制了一种基于液滴中数字核酸信号放大的替代分析平台，平台方案如图6所示。首先，将含有目标DNA、寡核苷酸包被的微珠和其他基本成分的水相与油相混合，形成油包水微乳液。这种分布过程可确保目标DNA在液滴中形成单分子水平的分散体。只有当液滴同时包含目标DNA和寡核苷酸包被的微珠时，才会触发级联信号放大反应。使用基于微珠的可控延伸桥接级联信号放大反应，实现了超低背景、高效率和高特异性的核酸信号放大分析[1]。

图6：基于微珠的数字核酸信号放大平台方案[1]

2.5 其他微流控数字PCR 

基于微流控的数字PCR技术的实现方式除了前文所述之外还有很多，L.Xu等人设计了一种便携式集成数字PCR(PI-dPCR)系统，可以直接从人类尿液样本中对多瘤(BK)病毒载量进行数字量化检测。该系统带有自分区滑动芯片微流控装置，这种数字自分区滑动芯片微流控利用滑动诱导的自分配机制，通过简单的滑动操作生成大量水滴，利用包含由浅而窄的桥通道连接的微孔的微通道进行流体加载。PI-dPCR系统占用面积小、质量轻,并且与热控制和荧光成像模块集成，与需要在接触表面上精确重叠微特征以建立流体加载路径的传统滑动芯片设备不同，这种自分区滑动芯片设备利用具有交替深度和宽度的微通道进行流体操作。该系统还可以通过简单的“样本到数字结果”操作流程，直接从原始尿液样本中量化BK病毒。PI-dPCR系统定量分析尿液样本中BK病毒载量的工作流程如图7所示，无需复杂的核酸提取和纯化步骤，它为在现场快速检测和监测病毒感染提供了一种有前途的方法[1]。

图7：PI-dP CR系统定量分析尿液样本中BK病毒载量的工作流程[1]

早期开发的ddPCR平台使用微流控流动聚焦方法产生单体积液滴用于PCR分析。但是dPCR分析中使用的液滴具有相同的体积，检测的动态范围相对较窄，在处理浓度差异较大的样品时，需要大量的液滴，从而影响读出时间和芯片的小型化。多体积方法由于其宽动态范围特性而在ddPCR领域引起了广泛关注[1]。

2022年，C.Y.Wei等人提出了一种高度集成和小型化的用于ddPCR的多体积微流控装置。如图8所示(图中h为通道高度)，其采用“非对称液滴分裂”微结构，制备不同大小的两种液滴用于多体积ddPCR，可实现超过104的动态范围用于DNA分子定量检测。小液滴主要用于提高系统分辨率以量化高浓度样品；大液滴主要用于提高系统在低浓度样品中追踪DNA分子的灵敏度。此外，液滴体积可根据流体流速进行调节。因此该装置对处理具有大浓度差异的样品，具有更强的定量检测能力。通过检测含有鸡DNA模板样品的ddPCR结果表明，该装置具有出色的核酸定量检测能力，有望拓展DNA分子定量检测的应用场景，特别是在需要扩展动态范围的高效定量检测领域[1]。

图8：多体积ddPCR芯片示意图[1]

2.6 商业化公司

法国Stilla Technologies公司在2019年发布了高通量数字PCR系统-Naica HT和新型的Opal芯片，Opal芯片上可以同时运行16个样本，一次反应可以运行48个样本，每天能检测240及以上个样本，较一般有4个样本孔的芯片通量提升了4倍，每个样本孔可实现6个荧光通道的检测，可智能化识别液滴并进行质控。相较于qPCR，其灵敏度更好，分辨力更好，可有效实现低浓度、低丰度的核酸样本的准确定量检测。基于液滴式的BioRad QX200 dPCR系统和基于阵列式的QuantStudio 3D dPCR系统等商业平台也已成为临床应用的关键设备[1]。

3. 基于微流控技术的数字PCR的应用

与qPCR相比，基于微流控的数字PCR具有很高的灵敏度和特异性，数字PCR的绝对定量检测比qPCR的相对定量检测的准确度高很多，因此基于微流控的数字PCR可以满足不同检测场景的应用需求，目前这项技术已经被广泛地用于定量检测、精准分子诊断、肿瘤个性化诊断以及食品安全检测等领域，特别是在临床应用上，都可以对诊断和治疗提供精准的检测数据，以供后续临床诊断和治疗[1]。

3.1 定量检测

DNA和RNA的定量检测为研究基因表达提供了有价值的信息，并有可能有助于对疾病(包括中风、白血病和前列腺癌)的评估、移植排斥反应的分析和疫苗的开发。定量检测面临的挑战是控制DNA拷贝数和质量之间的转换[1]。

随着技术的进步，单细胞水平的转录组学变得更便捷。逆转录数字聚合酶链式反应(RT-dP CR)是一种强大的技术，它允许以非常窄的置信区间估计基因组拷贝数，在非常低的浓度下检测目标，并根据不同处理方式准确分析目标数量的变化[1]。

大多数现有液滴平台依赖于在单个预定时间点连续测量每个液滴及其测定反应物。为了解决这个问题，进行微流控阵列中每个分区的实时荧光检测是消除假阳性和假阴性分区的有效方法[1]。

3.2 精准分子诊断

分子诊断是指在分子层面对机体的遗传物质进行诊断、评估的一种技术。一些在感染潜伏期的病毒，血浆浓度太低，导至传统的检测方式无法准确检测感染程度。基于微流控的数字PCR的绝对定量检测在分子诊断中有惊人的优势，数字PCR可以准确快速地对核酸拷贝数进行定量检测，所以数字PCR在病原微生物的检测中有极为重要的作用[1]。

3.3 肿瘤个性化诊断

数字聚合酶链式反应的出现将基因突变的检测提高到前所未有的精度水平，尤其是在癌症相关基因中。高精度的数字PCR测量可用于肿瘤的早期诊断，且由于其DNA定量的高精度和灵敏度，dPCR正迅速成为诊断多种癌症的有力工具，例如dPCR已常用于检测非小细胞肺癌 (NSCLC) 中的表皮生长因子受体 (EGFR) 突变、肺癌、结直肠癌中的 KRAS 突变和乳腺癌中的ESR1突变[1]。

3.4 食品安全检测

随着经济的发展和人们需求的提高,食品安全问题的关注度也逐渐提高。食源性病原体引起的问题经常威胁到全世界人类的安全和健康。微流控dPCR装置减少了样品和试剂消耗，可以在较短的时间内对食品中的核酸拷贝数进行绝对定量检测，因此在食品检测领域可以得到广泛应用。目前，微型化、便携式和低成本的微流控设备已被引入食品安全的检测[1]。

4. 总结与展望

数字PCR是为了克服传统扩增技术的局限性而开发的，特别是用于检测少量的核酸或罕见的变异体。数字PCR采用终点检测，与qPCR不同，它不依赖标准曲线与参照样本而直接检测目标序列的拷贝数，检测下限可达单拷贝水平，相比于qPCR，其拥有更加出色的灵敏度、精度。微流控技术的发展为数字PCR带来了更多的便捷性，自从证明了微流控装置中的第一个PCR以来，至今已经开发了许多技术。将微流控技术与数字PCR相结合，旨在提高效率，降低设备的复杂性，使得数字PCR的操作和检测更加便捷，并集成了其他功能，例如样品制备和检测等，而且集成的微流控数字PCR装置对于高通量应用具有很大的优势。集成微流控数字PCR设备可在医生办公室中进行测试，无需外部实验室，在科研上有极大的便利性。基于微流控的数字PCR已成为传统PCR的一种有价值的替代品，并有可能彻底改变该领域[1]。

基于微流控技术的数字PCR是对液滴的直观检测技术，无疑能更好地推动数字PCR在临床中的实际应用。另外，DNA阵列和测序方法通常仅需要最少量的DNA或RNA，因此通过基于微流控的数字PCR技术进行样品检测结果会更为精准，所以在同一微流控装置上集成PCR和DNA阵列或测序方法也是未来一个可考虑的研究方向。但目前基于微流控的数字PCR仍在发展中,微流控芯片的消耗将提高检测成本，制作低成本芯片并使研究成本显著降低是未来研究者关注的方向之一[1]。

由于数字PCR依赖于将DNA分子从散装溶液中分割成单独的体积，将反应拆分成了数万个独立体系，因此其对模板量有比较高的要求。而且由于数字PCR采用终点荧光，同样存在普通PCR存在的引物特异性问题，只要荧光信号足够强，反应单元的结果也会判读为阳性，因此对数字PCR的引物特异性要求也极高。此外，许多数字PCR设备没有解决提供简单用户界面的问题，虽然微流控设备比传统的台式系统具有更大的优势，但传统的PCR用户可能无法使用微流控技术，因为他们缺乏操作设备所需要的专业技能[1]。

未来的研究方向，特别是在数字PCR设备方面，应侧重于将微流控方法易于被用户使用，降低复杂度，从而推动基于微流控的数字PCR的广泛应用。随着微流控技术的进一步发展，基于微流控的数字PCR技术会更加成熟，灵敏度和精度都将再度提高，并将在各种临床应用中发挥出其特有的作用[1]。

[5]McCarthy Riley, Bailey F., Cassandra L. Ward, and Thomas H. Linz. "Influence of microfabrication on digital PCR performance in bead-based microwell array assays." Analytical and Bioanalytical Chemistry 412 (2020): 6917-6926.