微流控芯片材料PDMS表面改性

20世纪90年代，Manz A等人首先提出微型全分析系统(miniaturized total analysis system，u-TAS)的概念，其中芯片式u-TAS也称芯片实验室(Lab on a chip)，根据原理不同分为微流控芯片和微阵列芯片。

微流控芯片又称芯片实验室 (Lab on a Chip)，是微机电加工技术 (MEMS)的一个典型应用，在硅、石英、玻璃或高分子聚合物等基质材料上加工出微管道、微阀、微泵、微反应器、电极等功能单元，基于分析化学的相关理论和技术，实现生物或者化学领域所涉及的样品纯化、反应、萃取、分离、检测等一系列功能的实验装置，以微尺寸效应为基础，以微管道网络为基本特征，以微流体为核心。

微流控芯片结合“微”和“全”的优点，具有较高的分析效率和极少的试剂消耗量，实现生物样品分析检测的集成化、自动化、便携化。从本世纪初开始，微流控芯片技术得到飞速发展。作为微流控芯片的基本载体，材料对芯片加工精度和功能等有极其重要的意义，芯片材料的研究也在不断深入。

1.1微流控芯片应用

微流控芯片所表现出的整体性和系统性具有难以估量的潜在能力，使得微流控芯片具有了强大的发展活力和美好的应用前景。随着研究工作的深入展开，微流控芯片的发展已经远远超越了发展初期的雏形一毛细电泳芯片，主要应用方向包括蛋白质、核酸等的分离分析，以及酶分析、免疫分析、多相化学反应等，已经涉及的应用领域包括疾病诊断、环境检测、食品安全、司法鉴定、体育竟技以及反恐、航天等事关人类生存质量的诸多方面。

1.2微流控芯片材料

微流控芯片材料主要分为硅质材料、聚合物材料和其他材料，其基质材料具体分类、优缺点如下表所示。

硅材料具有良好的化学惰性与热稳定性，基于微电子领域的加工技术，最早用于制作微流控芯片。但是硅材料易碎，成本高，透光性差，电绝缘性能差及表面化学行为较为复杂，这些都大大限制了其在微流控芯片中的应用。石英和玻璃具有良好的电渗和优良的光学性质，其表面吸附和表面反应能力都有利于表面改性，但是价格相对较高。使用与硅片类似的光刻和表面改性技术可以将微结构转移到石英和玻璃上，加工工艺成熟。因此，玻璃材料近来被广泛应用于制作微流控芯片。然而，以玻璃和硅为主要制作材料，其制作过程依赖标准光刻技术，由于成本高、工序复杂、易污染以及通道几何尺寸受限等缺点。

高分子聚合物材料种类多，加工成型方便，价格便宜，尤其是高聚物材料有良好的光学性质、化学惰性、电绝缘性和热性能等，使其在微流控芯片领域的应用具有得天独厚的优势。可用于制作微流控芯片的高聚物材料大致可分为三大类：热塑性聚合物、固化型聚合物和溶剂挥发型聚合物。目前，已有大量的高聚物材料被用于微流控芯片加工中，如聚酰胺(PA)、聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)，聚碳酸酯(PC)，聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)和聚二甲基硅氧烷(PDMS)等。

1.3 PDMS

在众多高聚物微流控芯片中，聚二甲基硅氧烷(ploydimethylsiloxane，PDMS)微流控芯片是应用范围最广的芯片之一。其结构式如下图所示:

PDMS以其独特的优势在微流控芯片中得到应用：材料廉价、易得；材料可加工性、成型性好，可以通过快速模塑法制作不同通道形状的微流控芯片；可以透过240nm以上波段的紫外、可见光，适合各种光学检测；不透水，不溶于水和常见电泳缓冲液；可以透过空气，对细胞无毒，适合生物样品检测；表面能低，容易和其他材料进行可逆或者不可逆键合；有良好的绝缘性，良好的散热性能，适于电泳分离；材料表面易于进行改性，适合不同要求的生物样品分析检测；容易质谱等其他分析检测技术联用。

PDMS材料在性能上也有一些缺陷：表面疏水，缓冲液很难注入，表面吸附作用强，需进行表面改性和修饰才能进行应用，导热性差，导热系数比玻璃低8-10倍，不利于焦耳热的散失，限制了单位长度上的场强；PDMS 材料的弹塑性决定了它的微结构不像其他刚性材料的结构那样的稳定。

由于PDMS材料具有高度疏水性，对生物分子特别是大分子蛋白具有强烈的非特异性吸附。在样品分离时，由于吸附作用容易产生严重的拖尾、蛋白质分离失败、失活的现象，严重限制了PDMS在微流控芯片领域的应用。

蛋白质在材料表面的吸附是一个动态的过程，它包含蛋白质的3个过程：吸附、重排和解吸附，也是一个复杂的过程，与范德华力、疏水相互作用、静电和氢键作用有关。正是由于蛋白质特殊的结构以及和材料表面之间大量复杂的、相互依赖的、动态的相互作用，蛋白质与材料表面的相互作用机理及材料表面性质对蛋白质吸附行为的影响至今仍未完全阐明，但其重要性已经受到研究者的广泛重视。

一般认为，决定蛋白质在材料表面吸附和解吸附行为的物理化学因素通常有八种，如下图所示。

蛋白质在材料表面的吸附和脱附过程

从蛋白质靠近生物医用材料表面，到在材料表面吸附，再到从材料表面解吸附,其中的每一个过程都有其特征。在靠近过程中，蛋白质的运输性质、蛋白质与材料表面的本征相互作用共同决定蛋白质靠近材料表面的程度，此过程同时受溶剂分子运动和蛋白质自身分子运动性质的影响。

2.1蛋白质吸附过程中的相互作用力

蛋白质吸附过程中的相互作用力主要包括疏水作用力、范德华力、氢键和静电相互作用，这些作用力直接决定着蛋白质在材料表面吸附的稳定程度及吸附的数量。其中氢键的形成是由于电负性原子与氢原子形成的基团中，氢原子周围分布的电子少，正电荷氢核与另一电负性强的原子之间产生静电吸引，从而形成氢键。疏水相互作用又称为非极性相互作用，发生于非极性基团之间，蛋白质同时含极性和非极性的基团，当蛋白质处于水溶液中时，极性基团之间以及极性基团与水分子之间易发生静电吸引而排开非极性基团，因此疏水相互作用并非是疏水基团之间有吸引力的缘故，而是由于非极性基团避开水的需要而被迫接近。这些相互作用本质上与小分子的吸附没有差别，而蛋白质吸附的独特性在于吸附的是具有生物活性的大分子，以及在吸附过程中蛋白质可以发生各种物理(如构象变化)和化学的变化，从而导至生物活性的变化此外，蛋白质的空间结构和表面酸性氨基酸、碱性氨基酸基团的密度会影响其吸附，同时材料的表界面性质对蛋白质的吸附速率、吸附量和吸附机理有重要影响。

吸附过程中有两种趋动力促使蛋白质在材料表面发生吸附，即溶液中蛋白质的浓度以及蛋白质与材料表面的结合力。由于不同蛋白质与材料的结合力不同，导至蛋白质之间存在竞争性吸附行为，即各种蛋白质的解吸附和置换吸附的发生。最初吸附的蛋白质趋向于发生依赖时间的构象转变，且能被其它与材料表面具有更高亲和力的蛋白质置换下来，这种依赖于时间变化的蛋白质置换被称为Vroman 效应。这种竞争性吸附行为是一个复杂而连续的过程，故最终所得吸附层中蛋白质的类型和数量与植入材料所处环境内蛋白质的组成不完全一致。此外，氢键、静电和疏水作用等非共价相互作用都会对其吸附过程造成影响。由于蛋白质分子中极性带电氨基酸残基大多数暴露在表面，故通常认为静电相互作用是蛋白质吸附的主要动力之一，而这三种相互作用的本质都与静电作用有关。

2.2蛋白质吸附和脱附过程

通常材料与生理环境相接触时，蛋白质及相关生物大分子会很快吸附在材料表面。这种吸附的过程是一个复杂的动态过程。蛋白质首先在浓度梯度的作用下与材料表面无限接近，接着在材料与蛋白质的相互作用力下使蛋白质黏附在材料表面，并导至蛋白质分子发生构象变化使之逐渐铺展重排，形成更多的位点与材料表面接触。在外界条件的扰动下，吸附在材料表面的蛋白质会脱附下来，留下的位点很快又会被其他蛋白质所占住。蛋白质吸附到材料表面的传输过程主要受到如下4种传输机理中一种或多种共同起作用：扩散，热对流，流动，互传输。蛋白质在材料表面脱附的过程相对于小分子来说要困难的多，这主要是由于蛋白质本身的体积及与材料表面的结合的位点数目所决定的。一般蛋白质及相关生物大分子在材料表面的脱附主要是如下3个因素所导至：热扰动，剪切流动，其他能够更稳定地吸附于表面的物质与蛋白质或其他生物大分子竞争吸附所做的功。

2.3蛋白质在材料表面吸附过程影响因素

蛋白质在材料表面间的吸附主要有蛋白质、溶液、材料等因素决定，其吸附过程是一个受到各种因素综合影响的过程，具体影响因素如下图所示，其中材料的影响主要包括：材料表面拓扑结构、表面化学性质、表面电荷状况的因素。

2.3.1蛋白质

蛋白质的结构复杂，按其空间结构主要分为三类：一级结构肽链中的氨基酸序列，多肽链中规则重复的构象(二级结构)，以及与其生理功能关系十分密切的三维空间结构(三级、四级结构)。研究表明蛋白质本身的性质会对其在材料表面的吸附行为产生影响，而这种影响主要与蛋白质的一级结构有关即氨基酸的序列。尺寸较大的蛋白质可与材料表面形成更多的接触位点，从而导至吸附量的增加。同时蛋白质表面所带的电荷数目、结构的稳定性和伸展速率也会影响其本身在材料表面的吸附，通常容易发生伸展的蛋白质或蛋白质分子在其对应的等电点附近会更容易地吸附到材料表面

2.3.2 溶液

由于蛋白质本身是一种两性电解质，介质溶液的温度、pH、浓度、离子强度等会直接导至蛋白质构象状态的改变，这种改变将直接影响到蛋白质与材料表面的相互作用。同时对于多元的蛋白质溶液来说，不同蛋白质之间的竞争吸附也影响蛋白质在材料表面的吸附。

2.3.3 材料

表面拓扑结构影响蛋白质吸附过程如下：粗糙及多孔的表面能提供更多的机会与蛋白质分子相互作用；多孔材料的孔径大小、分布和孔隙率等决定了与蛋白质分子作用的表面积大小；沟槽的尺寸和取向则会影响蛋白质吸附的种类、数量以及构象变化。

表面化学性质决定蛋白质与材料表面相互之间作用力的类型：亲水性官能团如羟基、氨基、羧基、酸氨基、磺酸基等可降低蛋白质的吸附；硫醚、醚键等对蛋白质吸附的影响不大；刚性基团如芳香聚醚类则不利于蛋白质的吸附。

疏水性表面倾向于吸附更多的蛋白质，且与蛋白质分子的结合力也更强一些；亲水性表面对蛋白质的吸附作用较弱且可逆。

材料表面电荷状况影响溶液中的离子的分布，进而影响蛋白质与材料表面的相互作用。

由于PDMS表面具有高度疏水性、对大分子蛋白质有较强的吸附作用，因而寻找一种有效的PDMS表面改性方法是尤为重要的。

高分子材料改性方法按改性范围可分为：表面修饰法、整体修饰法，其中表面修饰法使用的最为广泛，细分为物理修饰法、化学修饰法两大类。

3.1PDMS表面改性方法

3.1.1 物理修饰法

物理修饰法采用高能物质作用于PDMS表面，以改变PDMS表面化学的组成性质、或是在PDMS材料表面沉积一层新材料。主要方法包括等离子体处理、紫外光(UV) 照处理、紫外光照加臭氧(UVO)处理、及激光处理等。采用这些方法进行PDMS表面处理，操作简单，能在PDMS表面生成羟基等亲水性基团而使其亲水性电渗流特性得到明显的改善。但是物理改性的最大缺点是，改性后的表面性质会随着使用或放置时间的增加而逐步退化，其原因为PDMS中未固化交联的单体向表面扩散，导至表面接枝层密度减小。另外，物理改性需要等离子体发生器、紫外光源等设备，有些还比较昂贵。特别要指出的是: 通过等离子体和紫外光处理后，两片PDMS之间可以形成不可逆的封接，对于改善PDMS的封接强度非常有效。

3.1.2 化学修饰法

化学修饰法可分为：湿法修饰和通过共价键结合的表面接枝法。所谓湿法修饰即直接使待修饰溶液接触PDMS表面，使拟修饰到PDMS表面的组份通过物理吸附或静电等作用力被吸附于PDMS表面。常见的湿法修饰有层层自组装(layer-by-layer (LBL) deposition)、溶胶凝胶包被、动态表面活性剂修饰及蛋白吸附等。这类修饰方法的共同特点是：修饰方法总体较为简单。但是由于PDMS表面与修饰层之间并非依靠共价化学键连接，所以修饰层的稳定性欠佳，容易随使用时间的增加而流失。

通过共价键结合的表面改性是通过化学反应使修饰层以共价键键合于PDMS表面。如果修饰层也是一类高聚物，这样的表面修饰也称为表面接枝。这类修饰方法的最大优势是修饰层稳定，改性后的表面性质保持时间长，是PDMS芯片化学修饰比较常用的方法。但是相比于湿法修饰，该方法操作比较复杂，难度也比较大。

3.2 PDMS紫外光照处理

光照处理前后的红外光谱图如下图所示。由结果可以看出，与未光照样品相比，真空紫外光照后，PDMS表面红外光谱图发生了以下变化：3400cm-1处出现了-OH的对应峰；2960cm-1处甲基的非对称仲缩振动峰、1260cm-1处甲基的对称弯曲振动峰、1070cm-1处-Si-O-Si-的非对称伸缩振动峰均有不同程度的降低；909cm-1处出现了-Si-OH中-Si-O的伸缩振动峰；794cm-1处-Si-C的伸缩振动峰减弱。

从上面分析可以看出，在真空紫外光照射条件下，PDMS表面会发生如下反应：高能量的真空紫外光将Si-O、Si-C等化学键打断，生成的自由基与体系中残留的氧在紫外光照射条件下发生反应，形成Si-OH化表面，Si-OH之间相互反应脱去水分了，形成-Si-O-Si-网状类结构。

PDMS紫外光照改性前的表面水接触角为110°，表现出极大的疏水性质，但经过真空紫外光照处理后，表面水接触角变小，亲水性增强。由下图PDMS表而水接触角随光照时间变化图可以看出，随着真空紫外光照时间的延长，PDMS表面水接触角逐渐下降，在光照时间为10min时，水接触角接近 0°，表面变得几乎完全亲水但这种良好的亲水性难以得到长久的保持。

PDMS表面水接触角随光照时间变化图

如下图所示，真空紫外光照处理10min的PDMS在放置过程中，随时间延长，其表面水接触角呈逐渐上升趋势，但最终稳定在73°左右，体现了较好的亲水改性效果，也与红外光谱图检测结果相符。相比其他文献中所述，其疏水性恢复的时间也大大延长。

目前，研究者们对于PDMS疏水性恢复机理还没有形成共识，但比较统一的观点认为：PDMS表面经真空紫外光照改性后，产生大量极性基团(如-OH)，使表面能升高，处于不稳定状态。为了降低表面能，使系统重回稳定状态，PDMS表面的极性基团和本体内部的非极性基团会发生翻转，使得表面亲水性下降。

光照后PDMS表面水接触角随时间变化图

3.3 PDMS表面枝接聚乙二醇(PEG)

3.3.1 枝接过程

PDMS表面枝接聚乙二醇实验过程如下图所示。由于PDMS具有一定的惰性，因此，在进行表面接枝反应之前需对其进行表面官能化以引入活性反应位点。首先通过在PDMS表面引入Si-H键的方法来达到表面活化的目的。在浓盐酸的催化作用下，PDMS表层的Si-O键和含氢硅油中的Si-O键同时断裂并发生重排，从而在PDMS表面引入Si-H键。烯丙基聚乙二醇的一端带有双键，利用此双键与PDMS-H上的Si-H键反应将PEG接枝PDMS表面。

PDMS表面枝接聚乙二醇（PEG）

3.3.2实验结果和表征

衰减全反射傅立叶红外光谱测试结果表面（如下图），相对于PDMS，PDMS-H样品在2166cm-1处出现了一个明显的吸收峰，此为Si-H键的伸缩振动峰，这说明Si-H键已成功引入PDMS表面。

利用Si-H官能团与不饱和化合物在过渡金属铂所组成的催化体系下进行的硅氢加成反应可在红外测试分析结果表明，当PDMS表面Si-H官能化后，该表面在2166cm-1处出现一个明显的Si-H吸收峰。但经过硅氢加成反应接枝PEG后，2166cm-1处的吸收峰消失，取而代之的是2873cm-1，和3500cm-1处的两个新的吸收峰。其中2873cm-1处的吸收峰为PEG中的-CH2-O-的特征峰，而3500cm-1处的吸收峰则为PEG末端羟基的特征峰。Si-H键特征峰的消失和PEG两个新特征峰的出现表明，PEG已成功接枝到PDMS的表面。

PDMS表面接枝PEG各步反应的反射式红外图谱

下图反映的是接枝PEG前后膜片表面纤维蛋白原吸附量及水接触角的变化。由于纤维蛋白原是生物医学领域中用以评价材料生物相容性的一种常见蛋白质，故本实验选用纤维蛋白原为模型蛋白以定量研究蛋白质在样品表面的吸附状况；而表面亲疏水性的改变也可在一定程度上定性分析材料表面化学组分的变化。从这些结果可以看出，未改性的PDMS膜片表面能低并呈现疏水性，水接触角达107.20°，这种低表面能的疏水性表面能引起明显的非特异性蛋白质吸附，纤维蛋白原的吸附量达0.47μg/cm2。而聚乙二醇则具有良好的亲水性，在水溶液环境中接枝到表面的PEG分子链能通过快速的运动使其具有较大的排斥体积，从而能有效的排斥非特异性的蛋白质吸附。故接枝PEG以后水接触角下降到60.5°，纤维蛋白原的吸附量则骤降至0.028ug/cm2。蛋白质吸附量及水接触角的显著下降进一步表明 PEG已成功接枝到PDMS表面。

枝接PEG前后膜片表面纤维蛋白原吸附量及水接触角的变化

3.3.3枝接PEG抗蛋白质吸附机理

随着对蛋白质污染问题研究的不断深入，研究者们开始探索抗蛋白质吸附材料的抗蛋白质吸附机理，从而最终指导抗蛋白质吸附材料的设计与合成。然而，由于蛋白质在材料表面的污染是个复杂的过程，材料的表面性质，包括表面基团的化学组成、亲疏水性、电荷、材料表面水分子状态、表面自由能和表面张力、表面能分量、表面分子运动以及表面粗糙度等，都有可能影响材料的抗蛋白质吸附性能，加之蛋白质分子结构的复杂性，目前为止尚未建立得到广泛认可的抗蛋白质吸附机理，有时得出的机理会不完全一致甚至相互矛盾。但是，人们也根据实验事实提出了一些假说，下面主要介绍一下普遍得到认可的空间位阻理论、水化层理论以及表面电荷理论。

其中表面电荷理论着重于静电作用，由材料表面、蛋白质的电荷性质、溶液pH和溶液离子强度共同影响。实用于解释PDMS表面枝接PEG抗蛋白质吸附机理只有空间位阻理论、水化层理论。

(1)空间位阻理论

PEG是常见的具有优异抗蛋白质吸附性能的聚合物。PEG分子的抗蛋白质吸附机理通常用空间阻力模型来解释。这种模型认为，PEG分子能迅速形成水化聚合物链具有很大的排除体积，从而防止蛋白质到达PEG表面。当蛋白质分子接触PEG表面并发生粘附时，会在较大程度上压缩PEG链的排除体积，PEG分子构象受到限制是一种嘀减的不稳定状态（如下图所示）。这种大的排除体积也来自于PEG链在水溶液中良好的运动性，PEG链的快速运动使得蛋白质等大分子不容易发生不可逆粘附。空间位阻理论得到了研究者们的普遍认可，被广泛用来解释PEG的抗蛋白质吸附现象。实验和分子模拟证明PEG的抗蛋白质吸附能力取决于PEG链在材料表面的密度和长度。PEG分子的表面覆盖度越大，链段越长，其抗蛋白质吸附效果越理想。然而对这一结果也存在着一定的争议，有人用单链平均场(SCMF)理论证明表面覆盖度是决定PEG抗蛋白质吸附能力的最主要因素，而PEG链长对抗蛋白质吸附效果影响不大。

抗蛋白质吸附的位阻排斥理论

(2)水化层理论

水化层理论认为，抗蛋白质吸附材料首先与水分子发生作用，紧密结合相当数量的水分子形成水化层，成为蛋白质在表面吸附的屏障：蛋白质要在材料表面吸附，必须突破这层屏障。另外，蛋白质高级结构的维持需要水分子来参与必要氢键的形成，而抗蛋白质吸附表面则能吸附水分子，不会影响到蛋白质分子内部和表面的水分子，从而有效维持了蛋白质分子的三维结构。