据WHO统计，由病原微生物引起的感染性疾病是人类死亡率和发病率最高的疾病之一。近年来，我国感染患者数量不断增加，医生送检意识不断提升，病原检测量逐年增多。mNGS因其通量高、无需培养、可同时检测上万种病原等特点迅速崛起，但其检测费用高昂，难以为普通患者所接受。 新需求催生新应用。基于多重扩增的病原靶向测序技术（tNGS）具有检测精度高、周期短、成本低、受干扰概率低等特点，搭配测序和生信分析可满足呼吸道感染、血流感染、中枢神经系统感染等多种临床场景的应用需求，为医生更快速、准确地提供诊断依据，同时也能帮助患者减少经济负担。 但在tNGS技术的实际应用中，仍存在非特异性扩增等诸多堪称“拦路虎”的限制，影响病原检测的准确性，从而降低检测结果的真实性。下面我们盘点下究竟有哪些“拦路虎”。 不同研究者感兴趣的病原及基因种类均不相同，通常将感兴趣的病原称为目标病原，感兴趣的基因片段称为目的基因片段。多重扩增时，要求所选择的目的基因片段彼此之间、目的基因片段和人源基因之间不存在同源序列。因为同源序列的干扰，可能造成引物在非靶标区域上扩增形成非特异扩增产物，从而降低目的基因片段的有效扩增。 造成引物二聚体主要有以下三个因素： 1）引物设计：如果多重扩增引物的长度、退火温度或引物间特异性等不满足要求，则易形成引物二聚体。 引物设计Tips： 特异性：多对引物间需尽可能避免互补（尤其是3’端互补）； 长度：引物过长则易形成引物二聚体，降低引物与目的片段的结合效率； 退火温度：引物Tm值需相对设置高一些，其引起的退火温度提高有利于扩增特异性的增加。 2）模板原因：模板质量较差（模板降解、杂质较多等）或目的基因片段较少，均可能导至引物缺乏靶向对象，只能“躺平抱团”，形成引物二聚体。 3）反应体系：即使模板正常、引物设计合格，如果反应体系中的组分配比不当，同样可能导至引物二聚体的形成。比如聚合酶的扩增性能太强、聚合酶含量过高、Mg2+太多，从而引起整个反应体系扩增能力的增强，进而令引物二聚体形成的概率有所增加。 Vazyme推出的多重扩增新品VAHTS Pathogen DNA Multiplex PCR Mix（Vazyme #NA301）和VAHTS Pathogen DNA&RNA Multiplex PCR Mix（Vazyme #NA312），两款产品针对性的使用定向进化的聚合酶，搭配精心优化的缓冲buffer，能较大程度地降低引物二聚体。使用Vazyme #NA301构建的DNA病原文库，引物二聚体reads占全部PEreads的比例可低至10.87%，显著高于同类产品；使用Vazyme#NA312构建的DNA&RNA病原文库，引物二聚体reads占全部PEreads的比例可低至14.59%。
此外，二者均具有优异的物种检出率和目标Reads检出率（结果如下图）。使用Vazyme #NA301构建的DNA病原文库，物种检出率均可达到87%，目标reads检出率高达76%；使用Vazyme#NA312构建的DNA&RNA病原文库，物种检出率可高达90%，目标reads检出率为40%，显著高于同类产品。
灵敏度（低拷贝病原微生物的检出）对于病原的精准检测有着重要的意义，检测灵敏度不足，可能产生假阴性结果，进而导至漏诊、误诊。可能的影响因素包括病原微生物本身的遗传物质丰度、样本背景中人源核酸片段和微生物的占比等。Vazyme #NA301和Vazyme #NA312二者均具有优异的检测灵敏度，即使病原丰度低至2 copies亦能从构建的文库中被检出，且能有效避免二聚体、非目的片段等的非特异性扩增，可有效防止漏检、误检。 起始投入的模板量多少，同样能够影响多重扩增的准确性。一般来说，若投入量过低，目的片段较少，可能导至引物与模板的相遇几率降低，从而引起引物二聚体的增加。为适应临床样本的实际检测需求，Vazyme #NA301和Vazyme #NA312对模板投入量的兼容范围更宽，能在不同的起始模板投入量下实现优异的多重扩增。Vazyme团队分别以人293细胞gDNA（起始投入量分别为1 ng、10 ng、100 ng、500 ng）和人293T细胞Total RNA（0.1 ng、1 ng、10 ng、100 ng、500 ng、1 μg）的逆转录产物为模板，用人源9重Panel进行多重扩增。结果表明，Vazyme #NA301和Vazyme #NA312具有优异的扩增特异性和均一性。
如果提取的核酸含有血红素、EDTA等血源性扩增抑制剂，这些抑制性杂质会对目的片段的特异性扩增产生干扰。Vazyme团队分别在扩增体系中添加0%、1%、2%、4%、8%、12%体积的含EDTA全血的病原核酸模板，进行多重扩增。结果表明，Vazyme #NA301和Vazyme #NA312均具有优异的耐受血液杂质效果。
背景菌是影响病原检测准确性的重要因素之一。如果检测试剂未经过背景菌质控，一些临床常见病原体（例如大肠杆菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌等）可能会同时存在于核酸提取背景和试剂背景中，难以区分检测出的微生物究竟来源于样本还是试剂。 Vazyme #NA301和Vazyme #NA312均经过了严格的背景菌质控，使用多参数指标检测原酶和化学原料背景菌；Vazyme公司拥有万级洁净生产车间、自动化分装系统、纯水系统，严控生产工艺；人工配制部分，更有全程QA、环境定期监测与消杀等质控手段；湿实验质控结果还会通过基于全面数据库的生信分析全流程为产品质量控制添上最后一道“防线”。 Vazyme新品搞定以上关键“拦路虎”，助力病原tNGS精准检测。 VAHTS Pathogen DNA Multiplex PCR Mix（Vazyme #NA301）和VAHTS Pathogen DNA&RNA Multiplex PCR Mix（Vazyme #NA312）是分别针对DNA病原单检和DNA&RNA病原共检的多重扩增试剂，均采用了改良的热启动技术，搭配定向进化的DNA聚合酶和精心优化的缓冲体系，能实现准确、均一、快速的多重扩增，适用于细菌、真菌、病毒、支原体、衣原体等多种病原微生物的检测。 对于病原tNGS检测，大家还关注哪些方面的问题呢？欢迎关注“诺唯赞生物”官方公众号或致电400-600-9335，一起交流探讨~ |
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