《British journal of cancer》ctDNA在结直肠癌MRD中的应用

微小残留病灶（MRD）定义为治疗后残留的微观肿瘤物质，临床上无法检测到，因此有可能导至疾病复发。最近，人们对循环肿瘤DNA（ctDNA）检测MRD和治疗后（包括手术切除和根治性放化疗）预后的能力非常感兴趣。

ctDNA检测仍存在一些限制。ctDNA仅占总cfDNA的一小部分，因此需要灵敏的检测方法。不确定潜能克隆造血（CHIP）是造血细胞中非肿瘤来源的体细胞突变，可能导至假阳性结果。ctDNA分析有两种主要方法。最初的测量依赖于基于PCR的针对少数基因位点的技术。这种专注的方法既快速又相对便宜。检测极低变异等位基因频率（VAF）的能力带来了高灵敏度，数字PCR和BEAMing技术能够检测低至0.01%的VAF。然而，基于PCR的技术依赖于癌症遗传特征的已有知识，并且多重能力有限。最近，下一代测序（NGS）的发展使得能够分析更广泛的靶基因，并能够筛选未知变异。除了体细胞突变外，人们对ctDNA的特征越来越感兴趣，包括甲基化和片段化模式。

目前，临床上仍然迫切需要一种更好的结直肠癌术后风险分层模式，目前的肿瘤标志物缺乏敏感性，并且在疾病复发后晚期升高。人们已经认识到，ctDNA具有巨大的应用潜力，在许多其他原发癌部位，包括胰腺癌、肺癌和乳腺癌中都得到了证明，但由于缺乏系统证据，对这种方法在结直肠癌中的有效性仍缺乏共识。

近日，来自英国的研究团队在杂志British journal of cancer上发表了一篇题为“The utility of ctDNA in detecting minimal residual disease following curative surgery in colorectal cancer: a systematic review and meta-analysis”的综述文章。本综述总结了术后ctDNA在检测结直肠癌根治性手术后MRD方面的效用，并比较了研究方法，以促进为未来研究和临床实践整合提供最佳研究设计建议。

来源：British journal of cancer

纳入共37项研究，涉及3002名患者。纳入的研究纳入了结直肠癌的所有阶段（I–IV），其中6项针对直肠癌。文章发表于1993年至2021年，在北美、欧洲、亚洲和澳大利亚等大洲进行。手术包括切除原发癌、局部复发和转移切除。中位年龄从55岁到73岁，男性参与者的比例从33-90%不等，平均53.2%。研究的中位随访时间为11.7个月至6.6年。23项（62.2%）研究描述了术后监测方案，包括体检、实验室肿瘤标志物（CEA、CA19.9）和放射学。

术后首次ctDNA测量的时间从手术当天到术后13个月不等。19项（51%）研究使用了基于PCR的方法，15项（31%）使用了NGS，其中3项研究监测了表观遗传变化。14项（38%）报告了检测的检测限（LoD），31项（86%）规定了建立ctDNA阳性的cutoff。在基因panel广度上几乎没有共识，评估的基因数量从1到1021。在16项研究中，ctDNA中评估的突变是基于先前在组织（15）或血浆（1）中鉴定的突变。其中，在肿瘤中评估的基因组大小从4个基因到全基因组测序（WGS）不等。在32项（86%）研究中，术前也测量了ctDNA。

各阶段研究选择过程和研究数量的流程图。来源：British journal of cancer

术后第一次液体活检时分类为ctDNA阳性的参与者比例为0至90.9%（中位数20%）。在3项研究中，没有患者在术后第一次液体活检时检测到ctDNA。ctDNA阳性受试者在随访期间复发的患者比例始终较高，且PFS中位数较短。根据术后ctDNA对21项研究（包括2645名参与者）进行了PFS的时间-事件分析。15项研究进行了多变量分析，12项研究评估了OS。持续观察到与ctDNA阳性相关的较短PFS，HRs在1.36和39.9之间变化。通过单变量分析和所有多变量分析，这在19项研究中具有统计学意义。

荟萃分析证实，术后ctDNA检测与预后不良相关，具有统计学意义[HR 6.92，CI 4.49–10.64，p < 0.00001]（如下图）。

结直肠癌手术后ctDNA的PFS荟萃分析。来源：British journal of cancer

根据辅助化疗的使用情况，在亚组分析中也观察到这种影响。辅助化疗HR 6.01，CI 2.96–12.21，p < 0.00001，无辅助化疗HR 10.3，CI 6.46–16.45，p < 0.00001；首次切除HR 7.93，CI 4.27–14.75，p < 0.00001，转移切除HR 5.08，CI 2.85–9.05，p < 0.00001；NGS:HR 8.87，CI 5.93–13，p < 0.00001，PCR：HR 5.37，CI 2.84–10.16，p < 0.00001（下图）。

基于疾病程度、辅助化疗和化验类型的亚组分析。来源：British journal of cancer

五篇论文中提供了比较总生存期（OS）的风险比率。在比较总生存期时，荟萃分析还发现不良预后与术后ctDNA检测阳性相关[HR 3.64，CI 1.63-8.12，p = 0.002]。

在多变量分析可用的情况下，还进行了荟萃分析HR 5.73，CI 3.34–9.84，p < 0.00001。统计检验显示出显著的异质性（p < 0.00001），I2值为77%，因此使用随机效应模型。根据标准误差绘制的效应值（HR）漏斗图显示出不对称性，表明存在出版偏差（如下图）。

漏斗图显示存在出版偏差。来源：British journal of cancer

在这篇综述中，研究团队证明结直肠癌根治性手术后ctDNA检测阳性与显著缩短的PFS有关。这一关系在多个研究中得到了一致的证明，研究团队首次通过荟萃分析证明，这种影响在统计学上是显著的。尽管有如此广泛的证据，但由于ctDNA研究在许多方面仍然没有共识，尤其是在ctDNA的分析时间和分析方法方面，这导至了本综述的巨大异质性，并且仍然是这一现象的临床效用的最大限制。

术后ctDNA测量可在多个方面影响临床管理。识别复发风险低的患者将能够识别不需要辅助治疗的个体，而辅助治疗完成后的ctDNA测量可用于确定是否需要进一步治疗。液体活检也可用于评估对其他治疗方式（包括根治性放疗）的反应。此外，ctDNA可用于指导治疗后监测，通过识别需要更深入监测的患者。

关于ctDNA采样时间的研究几乎没有共识。三项研究测量了术后和辅助化疗完成后的ctDNA，证明化疗后时间点是预后的更强预测因素。为了具有临床实用性，MRD的检测应在可能影响疾病管理的时候进行。延迟开始辅助化疗超过8周与更糟糕的长期结果相关，这意味着在纳入治疗途径时，术后ctDNA时间将是一个关键考虑因素。一旦从循环中清除了原发肿瘤的ctDNA，就应进行分析。测定时间的另一个重要考虑因素是cfDNA随生理压力（包括手术）而升高。Henriksen等人最近研究了结直肠癌和膀胱癌术后cfDNA和ctDNA的序列；他们发现，术后4周内，短cfDNA升高维持升高，并建议对术后未立即检测到ctDNA的患者在4周内重复进行ctDNA分析。

基因panel选择在精确肿瘤学的许多方面仍然是一个挑战。由于PCR和基于NGS的技术的结合，本综述中基因panel的广度存在很大差异。更全面的基因/突变panel将能够检测到更罕见的突变，但可能会出现CHIP的假阳性。

16项研究采用了先验肿瘤（tumour-informed）的方法，追踪先前发现的突变。这种个性化方法带来了提高特异性的优势，同时也使用基于PCR的检测实现了高灵敏度。然而，个性化化验开发的需要将在后勤上更难纳入日常护理。

鉴定体细胞突变的另一种方法是评估表观遗传变化。尽管在技术上测量更具挑战性，但甲基化变化在癌症类型中更为一致，并在癌症病理生理学早期发生。这篇综述中的四篇论文评估了基因甲基化。Parikh等人研究了103名接受I–IV期结直肠癌根治性手术的患者的NGS分析中的遗传和表观遗传变化，并得出结论，整合遗传和表观遗传变化可提高MRD检测的敏感性。

在MRD中，检测灵敏度具有重要意义。在我们纳入的研究中，Suzuki等人报告了使用ddPCR的最低LoD为0.02%。在三项研究中，没有一个队列在手术后检测到ctDNA，但在所有三项研究，一部分患者继续复发，这可能表明ctDNA水平低于这些检测的敏感性。本综述中的大多数研究测量了术前ctDNA。在三项研究中，术前检测ctDNA是纳入术后分析的一项要求，这可能有助于去除“非脱落者”或“低脱落者”，即肿瘤不释放ctDNA的患者子集。

统计测试表明，研究之间存在显著的异质性，这可能会影响本综述的重复性和外部有效性。这仍然是本综述和临床应用的主要限制。研究设计的差异将导至临床异质性。由于用于ctDNA分析的测定方法不同，这篇综述还将受到方法学异质性的影响。进行亚组分析可以部分克服这一问题。亚组分析仍然存在显著的异质性，可能是由于大量的变量。值得注意的是，统计测试表明转移切除亚组内没有明显的异质性，证实疾病分期是异质性的来源之一。