必看IF=65分顶刊！非血液来源的ctDNA临床转化的优势与挑战

近日，来自英国的研究团队在顶刊综述杂志Nature Reviews Clinical Oncology上发表了一篇题为“Circulating tumour DNA — looking beyond the blood”的文章。在这篇综述中，研究团队讨论了非血液来源的ctDNA分析的进展，重点是尿液、脑脊液和胸膜或腹膜液，和其他来源的ctDNA。文章讨论了这些替代来源如何对血液ctDNA分析具有独特但互补的作用，并考虑了非血液ctDNA测定开发的各个技术方面，还反思了非血液ctDNA可以提供优于血浆ctDNA的独特优势的环境，并探讨了将学术界的这些替代检测转化为临床应用所面临的一些挑战。

图片来源：Nature Reviews Clinical Oncology

“液体活检”是指在生物液体（传统上是血液）中发现的生物标志物，可以对其进行采样，以提供患者及其潜在恶性肿瘤的临床价值信息。迄今为止，大多数液体活检研究都集中在基于血液的生物标志物上，包括循环肿瘤DNA（ctDNA）、循环肿瘤细胞（CTC）和循环microRNA。各种研究证实了血浆ctDNA中检测到的基因组改变与肿瘤组织中发现的基因组改变之间高度一致。然而，过去几十年发表的数据表明，这些癌症衍生的细胞和分子也可以在非血液生物流体中发现，包括脑脊液（CSF）、尿液、胸膜液和腹膜液。相对于血浆，大多数非血液样品中的ctDNA与cfDNA的比率较高，这表明这些样品可能不易被非肿瘤来源的DNA稀释。在对某些液体（如尿液）进行采样时，获得更大的样品体积，既可以提取和分析更多的ctDNA，也可以提高灵敏度。

使用非血液来源ctDNA研究不同癌症的例子。图片来源：Nature Reviews Clinical Oncology

尿液中的ctDNA由两个不同的部分组成。第一个是经肾肿瘤DNA（trtDNA），它来源于血浆，通过肾小球滤过进入尿液，因此大小有限（通常<250 bp）。第二部分来源于直接从泌尿道脱落的肿瘤细胞（ucfDNA），并且由于不进行肾滤过，可以具有更大的分子量。

对trtDNA临床应用的大多数研究来自非小细胞肺癌（NSCLC）患者，测试EGFR和KRAS的突变，并可用于监测治疗反应和获得性耐药性的发展。trtDNA分析显示了在几种癌症类型中潜在的诊断效用，包括非小细胞肺癌（NSCLC）、胃癌、结直肠癌、胰腺癌和卵巢癌以及中枢神经系统（CNS）淋巴瘤。另外，trtDNA作为一种监测治疗后疾病状态的方法也已被研究。治疗后的定期尿液采样（可以在家中进行，样本通过邮寄返回）可以使患者早期发现疾病复发，与定期门诊就诊的策略相比，患者的依从性更高。

膀胱癌、前列腺癌和肾癌发生在尿道内，可将DNA片段直接释放到尿液中。ucfDNA分析的非侵入性，加上早期证据表明检测是可行的，增加了对其用于泌尿系癌症早期检测、尿路上皮癌患者疾病监测和复发预测的兴趣。

但尿液trtDNA测定法存在某些缺点，应予以强调。首先，trtDNA必须通过肾小球，这将片段的分子量限制在<250 bp。其次，肾小球滤过率控制着尿液trtDNA积累的速率，并且可以是高度可变的，特别是在接受全身抗癌治疗的患者中。另一个潜在的缺点是，排泄的大量尿液会对ctDNA产生稀释作用。使用cfDNA分离方案处理大体积样品在技术上更具挑战性。基于ucfDNA的分析的实施面临的主要挑战是分析性的，处理方法和收集时间的差异限制了这些方法的广泛采用。

由于血脑屏障限制了ctDNA和CTCs的转移，脑脊液成为中枢神经系统肿瘤ctDNA的极好来源。此外，相对于血浆，脑脊液通常含有较少的循环免疫细胞，这可能会降低脑脊液的总cfDNA含量，从而允许更敏感地检测低VAFs下存在的癌症特异性突变。

脑脊液中ctDNA的相对丰度是中枢神经系统患者中使用液体活检取样的关键考虑因素，也更能代表肿瘤负担。一些已建立的脑脊液ctDNA分子标记物包括1p/19q编码缺失和IDH1/2、H3F3A、HIST1H3B/C、ATRX、RELA、TP53、TERT和BRAF的改变，成功地将胶质瘤分型，并提供预后信息。同时，脑脊液ctDNA还与转移状态及无进展生存率密切相关，也可用于监测疾病复发的反应和/或检测，以及用于表征特异性耐药机制。

为了更广泛地使用基于CSF ctDNA的测定，需要进一步考虑某些实用元素。由于腰椎穿刺的侵入性，获取用于转化研究的样本（在没有脑积水等治疗指征的情况下）可能具有伦理挑战性。用于脑脊液分析的基于ctDNA的分析的其他限制因素包括样本量小、因排除腰椎穿刺禁忌症患者而产生的偏差以及技术问题，如腰穿过程中血液污染以及样本处理时间的变化等。

胸膜和腹膜液是血液的超滤液，由于缺乏外周血细胞，相对富含非造血cfDNA。恶性胸腔积液（MPE）和腹水可包含浸润胸膜和/或腹膜的肿瘤细胞，液体非常接近肿瘤组织，可能含有来自肿瘤细胞的ctDNA。

MPE具有较高的cfDNA含量，比组织和血浆样本更易于进行基因组分析。分析胸膜ctDNA的一个优点是，样本（通过胸腔积液获得）可立即用于基因检测，而组织样本通常需要按照标准的护理诊断流程进行常规组织病理学处理。此外，在胸膜液ctDNA中通常可检测到相比血浆样品中更多的驱动因素改变和可操作的变异。

关于样本采集可行性的类似考虑适用于胸膜或腹膜液抽吸：胸膜和/或腹膜抽吸术是一种中等侵入性手术，需要训练有素的操作员。对于不明原因的积液/腹水或者疾病复发或进展时，出于诊断或治疗目的进行抽吸是标准方法；然而，预先计划的重复采样以监测治疗反应可能不太实际。

唾液无需卫生保健专业人员在场即可非侵入性获取。唾液ctDNA（sctDNA）可被检测局部肿瘤如头颈癌的状态。此外，sctDNA还可能通过被动扩散、主动转运或通过粘膜超滤血液中的ctDNA，而起源于更远端的恶性肿瘤。

sctDNA的分析受到若干技术挑战的限制。在非小细胞肺癌患者中，基于dPCR的血浆和唾液样本中EGFR突变分析显示了高度一致性，尽管部分患者在血浆中有可检测到EGFR变化但唾液DNA样本中未检测到EGFR变化。这一观察可能是因为从血浆进入唾液的ctDNA浓度低。其他研究表明，sctDNA片段超短（40–60 bp），并且使用常规PCR技术可能无法扩增；这一观察导至了电场诱导释放和测量（EFIRM）试验的发展，以检测唾液中的EGFR改变。直接比较表明，EFIRM是比dPCR更敏感的检测方法，因此可能是评估HNSCC以外的恶性肿瘤患者唾液样本的最佳方法。

人类DNA通过细胞脱落和结肠细胞凋亡的组合进入粪便。然而，人类DNA仅占粪便总DNA含量的0.01%左右，其余来自胃肠道和/或饮食中的细菌。

CRC筛查是目前粪便DNA作用研究的一个重要焦点。使用测序Panel对粪便DNA样本进行分析表明，与粪便免疫化学和潜血检测相比，CRC检测的敏感性增加，尽管假阳性结果的风险增加。除筛查外，基于NGS的粪便DNA样本分析已成功检测出胃肠道癌症患者样本中已确定的癌症相关基因的一系列热点突变，从而突出了粪便DNA分析在精准医学和预测中的作用。粪便DNA的分析也可能具有超出肿瘤DNA检测的效用：对非小细胞肺癌患者粪便样品中16S核糖体DNA的分析表明，微生物组的组成可能与免疫检查点抑制剂患者的反应性和毒性相关，并可作为预测性生物标志物。

总之，粪便DNA有可能通过作为癌症筛查计划一部分的分析来改善结果，并提供关于单个肿瘤基因组特征的信息，从而为精确医学方法提供信息。当前的挑战包括粪便中可检测到的肿瘤DNA的稀少、对粪便微生物组的了解不足。依从性是一个限制，几项研究表明，参与者厌恶基于粪便的采样，这可能会阻碍此类方法的采用。

精液来源于精囊，可用于获取ctDNA进行分析。无细胞精液DNA（cfsDNA）通常以高于其他体液中cfDNA的浓度存在；cfsDNA的相对丰度可能是由于提供样品前的性禁欲（3-5天）（允许分泌的DNA积累）和由于其他精液成分的影响而降低的DNA酶活性。前列腺癌患者与非前列腺癌患者的cfsDNA比较表明，前者的中位浓度明显较高（428.45 ng/ml与25.4 ng/ml）。鉴于前列腺癌患者（如涉及NGS的患者）的csfDNA在该液体中的高浓度可用，尤其是因为该液体也可以非侵入性获得，因此有必要对其进行更全面的分析。

目前，基于cfsDNA的检测的临床应用的局限性包括缺乏用于样品收集和分析的明确方案；这些问题需要在广泛采用之前得到解决。此外，从雄激素缺乏后勃起功能障碍或放射治疗后精液量减少的患者身上获取精液样本可能会出现困难。在接受根治性前列腺切除术并切除精囊的患者中的效用也不可得。

除了已经讨论过的流体，还有其他几种可能的cfDNA来源。已在胆道癌患者的胆汁中鉴定出cfDNA，在检测癌症相关体细胞突变方面优于血浆ctDNA。在107名绝经后出血后接受宫腔镜检查和刮宫术的女性队列中，研究了子宫灌洗液作为cfDNA的来源。在随后被诊断为子宫内膜恶性肿瘤的所有7名女性中，都发现了癌症相关基因的突变。类似地，从子宫内膜癌妇女的卫生棉条采集的阴道液样本中可以检测到典型与子宫内膜癌相关的高甲基化模式。这些例子突出了涉及ctDNA技术应用的新方法的潜在范围，这些技术已经用于分析血浆ctDNA到其他体液中。

在将非血液ctDNA分析转化为临床的尝试中，必须克服几个挑战。

1. ctDNA的半衰期相对较短（约2 h）需要快速处理，这对使用更具侵入性的程序获得的样品提出了挑战，并且仍然需要简化从采集到处理的采样过程。含有防腐剂的稳定管可用，可将血浆样品中ctDNA的处理时间延长至48小时 然而，这些防腐剂对非血液来源的ctDNA的影响尚未确定。

2. 其他一些与运输和储存条件有关的分析前变量也没有得到解决，这些变量对于非血液来源的样品来说可能更难标准化。

3. 将侵入性取样程序（如胸膜抽吸和腰椎穿刺）纳入临床试验方案可能也很难证明其合理性。相反，尿液和唾液样本可以完全非侵入性地获得，并在许多时间点重复，对患者的风险最小。

4. 目前缺乏标准化的分析方法限制了非血液ctDNA在特定研究目的和/或临床试验中的使用。需要在临床试验中进行进一步的临床验证，其中非血液ctDNA检测用于确定治疗资格、时间或治疗选择。

非血液来源的ctDNA，其敏感性水平与血浆ctDNA的敏感性水平相当。然而，从多种生物流体中收集ctDNA可能是互补的，与单独分析血浆ctDNA相比，可以用于提高总体敏感性，并提供对不同解剖部位和时间的肿瘤特征的更深入了解。血浆ctDNA检测早期恶性肿瘤（筛查计划的目标）的敏感性可能低于晚期疾病，这突出表明，使用更接近原发肿瘤的生物流体进行检测可能是有利的。

从非血液体液中获得的ctDNA分析具有几个潜在的益处，从探索性研究到常规临床应用，例如能够更详细地分析特定解剖位置的特定肿瘤类型，以及完全无创性连续采样的可能性。然而，在临床上广泛实施非血液ctDNA检测之前，必须进行精心设计的临床试验，将结果用于指导治疗决策并证明对患者有意义的益处。

非血液来源ctDNA的优缺点。图片来源：Nature Reviews Clinical Oncology