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Scientific reports:cfDNA与早期结直肠癌生物标志物

2022-11-2 14:10| 编辑: 归去来兮| 查看: 2916| 评论: 0|来源: 小桔灯网 | 作者:动力彩虹

摘要: 从同一血液样本中测量多种生物标记物的多分析方法可能有助于检测早期癌症。


在癌症仍处于早期阶段时对其进行检测和治疗,可以挽救许多生命,降低发病率,并减轻癌症对医疗系统的负担。


液体活检是一种微创方法,用于检测体液如血液和尿液中的早期癌症。开发一种足够强大的液体活检检测方法来检测癌症有很多挑战,尤其是在早期疾病中,肿瘤仅向血液中释放微量生物标记物时。在早期疾病中,循环肿瘤DNA(ctDNA)仅占总无细胞DNA(cfDNA)的0.1–1%。从同一血液样本中测量多种生物标记物的多分析方法可能有助于检测早期癌症。


表观基因组学的变化可能先于肿瘤发生的遗传变化。因此,利用cfDNA的表观基因组进行癌症检测的兴趣越来越大。几个小组已经研究了是否可以通过cfDNA肿瘤部分的表观遗传修饰来检测癌症,因为DNA甲基化、DNA羟甲基化和cfDNA特征可能揭示染色质结构。胞嘧啶的甲基化产生甲基胞嘧啶(5mC)是一种众所周知的控制基因表达的表观遗传机制。5mC被氧化形成5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)。5mC和5hmC具有不同的功能作用:5mC存在于异染色质和常染色质中,通常抑制基因表达,而5hmC主要存在于常染色质,与大多数高转录的基因及其增强子相关。


癌症样本中不同的功能作用和分布表明,5mC和5hmC作为生物标记物具有独立的效用。然而,寻找癌症的表观遗传标记物受到了技术限制,区分5mC和5hmC的技术有限。然而,最近出现了几种技术来量化和利用5hmC特征用于通过液体生物检测进行癌症检测。5hmC在晚期转移癌中逐渐丢失的观察结果表明,其作为生物标记物的能力可能是阶段特异性的。


近日,来自剑桥大学的研究团队在杂志Scientific reports上发表了一篇题为“Hydroxymethylation profile of cell-free DNA is a biomarker for early colorectal cancer”的文章,在这项研究中,研究团队测量了整个cfDNA中的5hmC水平,并训练了一个分类器来区分结直肠癌患者和对照组。研究团队在一个独立的验证集中评估了分类器的性能,并评估了其对癌症分期和ctDNA水平的依赖性。研究表明,cfDNA的5hmC图谱是癌症的强预测因子,包括早期癌症检测的高灵敏度。数据表明,cfDNA表观遗传变化产生的5hmC信号在早期阶段比其他分析物更敏感。当5hmC信号与cfDNA片段特征相结合以产生附加信号时,这种灵敏度保持不变。


图片来源:Scientific reports


主要内容


从cfDNA中高效捕获5hmC以产生羟甲基化组学文库

研究团队仅用5 ng cfDNA捕获了含有5hmC残基的cfDNA片段的羟甲基化组学。从2ml血浆中提取cfDNA,使用5ng cfDNA制备Illumina兼容测序文库。测序文库被变性,单链文库被复制以创建一个双链文库,其中只有一链保留表观遗传信息。5hmC残基用修饰的葡萄糖基团进行标记,然后生物素化。使用链霉亲和素珠捕获含有双链DNA片段的5hmC。从5hmC捕获的文库中回收未经表观遗传修饰的复制链,并扩增形成羟甲基化组学富集测序文库。


所有样本中均包含对照DNA序列,以报告羟甲基化组学捕获的有效性和定量。阳性对照组含有1、3或6个5hmC残基,在羟甲基化组学中富集,与输入文库相比,分别多读88、267和658倍。含有6 mC残基或未修饰胞嘧啶的阴性对照未被浓缩(分别为1倍和0.38倍)(图B)。


羟甲基化组学中富集结果。图片来源:Scientific reports



5hmC分类器高效检测包括早期阶段在内的CRC

使用增强子区域中的5hmC水平训练监督分类器算法,以区分CRC和对照组(405个CRC样本和296个对照组)。将5hmC分类器应用于验证集(220个CRC和164个对照),区分CRC和对照组的AUC为90%。AUC 4期最高(94%),在1期略微下降至89%(图A)。


5hmC分类器的特异性为84%,CRC敏感性为80%(1、2、3和4期分别为78%、83%、75%和93%)。在验证样本中,当特异性固定在95%时,以55%的灵敏度检测CRC(所有阶段合并)。


研究团队训练了5hmC分类器,成功地将肺癌(AUC 80%)、乳腺癌(AUC 82%)和前列腺癌(AUC 79%)与对照组区分开来。还训练了一个5hmC分类器,将CRC与其他癌症区分开来(AUC 78%)。且结果表明5hmC分类器对低循环肿瘤DNA(占游离细胞DNA的比例)具有鲁棒性。


5hmC分类器高效检测各期CRC。图片来源:Scientific reports



5hmC分类器在低ctDNA比例下具有鲁棒性

为了进一步研究5hmC分类器在不同癌症阶段的性能相似的发现,使用ichorCNA肿瘤比例统计估计了验证集中cfDNA样本中ctDNA的数量。据报道,ichorCNA的检测限在平均测序深度为0.1x时为3%。


使用3%阈值作为检测限,5hmC分类器正确地区分了97%的可检测肿瘤比例的CRC样本和75%的肿瘤比例低于3%检测阈值的CRC样品(图C)。这表明,当在低ctDNA比例下,5hmC分类器是鲁棒的。因此,研究团队推断5hmC分类器不仅仅依赖于ctDNA部分。


5hmC分类器在低ctDNA比例下具有鲁棒性。图片来源:Scientific reports



白细胞介素信号可能推动基于5hmC的分类

为了研究驱动5hmC分类器在低ctDNA比例CRC样本中性能的生物信号,将分类器的特征增强子映射到基因名称,并在Key Pathway Advisor软件(Clarivate)中查询。IL11信号转导到PIK3CA级联是最重要的途径。这表明来自免疫系统的cfDNA片段可能驱动检测。研究团队进一步评估了仅使用早期CRC样本(1期和2期)训练分类器时识别出的特征,并将其与仅使用晚期CRC样本训练的分类器的特征进行了比较(3期和4期)。结果发现白细胞介素信号存在于晚期CRC中。


白细胞介素信号可能推动基于5hmC的分类。图片来源:Scientific reports



与5hmC分类器相比,片段组学分类器的性能对癌症分期和ctDNA比例的依赖性更大

为了调查观察到的5hmC分类器明显缺乏分期依赖性,研究团队研究了来自相同样本(验证集)的cfDNA片段特征。该片段组学分类器在验证集中以83%的AUC以及95%的特异性时62%的敏感性区分了CRC样本和对照组。


片段组学分类器的性能从4期CRC样品的91%下降到1期样品的80%。这表示检测早期CRC的性能损失比5hmC分类器高,5hmC在早期保持了性能。研究团队还训练了一个基于核小体定位的特征分类器。结果证明,在所有CRC阶段,基于增强子的5hmC分类器(AUC中位数为90.3%)在敏感性和特异性方面均优于片段组学(AUC中位数为83.1%)和NPS分类器(AUC中位数为85.2%)(图A-C)。


分类器的性能比较。图片来源:Scientific reports



5hmC可与其他特征共同提高分类器性能

为了捕获样本处理过程中产生的所有信息,研究团队训练了一个分类器,包括全基因组5hmC数据、基于全基因组区域的片段组学数据(如上所述),以及进一步的样本特征,如文库产量、全基因组片段大小分布和拷贝数相关数量。结果分类器在验证集中检测CRC的性能在95%的特异性下分别提高到AUC 91%和敏感性63%(图D)。


5hmC可与其他特征共同提高分类器性能。图片来源:Scientific reports



总结与讨论

早期发现癌症将提高生存率。血液生物标记物5-羟甲基胞嘧啶已被证明可以鉴别癌症。在一项针对2000多个个体血液样本的大型对照研究中,研究团队创建、测试并探索了基于5-羟甲基胞嘧啶的分类器用于检测结直肠癌(CRC)的特性。在独立的验证样本集中,分类器可从对照组中识别CRC样本的曲线下面积(AUC)为90%,敏感性为55%,特异性为95%。早期1期(AUC 89%)和晚期4期CRC(AUC 94%)的表现相似。即使其他方法检测不到血液中肿瘤DNA,分类器也能识别出CRC。扩展分类器以包括基因组中无细胞DNA片段大小和丰度的信息导至灵敏度提高(63%,95%特异性),总体性能相似(AUC 91%)。研究团队确认5-羟甲基胞嘧啶可以用于检测CRC,即使是在早期疾病中。因此,在多分析物检测中加入5-羟甲基胞嘧啶可以提高早期癌症检测的灵敏度。


当然,这篇研究也有一定的局限性。尽管报告了高特异性的结果,但由于癌症阴性个体的相对较少,不太可能完全解释无症状CRC筛查人群中存在的样本异质性、临床和人口统计学偏差,因此需谨慎地解释这些水平的表现。另一个限制是研究人群中选择偏差的可能性,因为血样是从结肠镜检查的患者中采集的,因此不能排除某些协变量对分类器性能的影响。


总的来说,这是迄今为止最大的一项研究,证明了5hmC通过血液cfDNA在异质、平衡的队列中检测早期CRC的能力,采用内部验证集来验证性能。总之,研究结果显示5hmC是一种强大的生物标记物,可用于增强检测早期和可治疗癌症的无创诊断工具。

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