IF=68,Nature子刊！DNA测序之外，纳米孔的其他应用

作为单分子生物传感器的纳米孔最初是为超灵敏DNA测序和其他无标记生物分子传感技术而开发的。在典型的纳米孔测量中，单个分析物在外加电位下进入纳米孔，这改变了通过纳米孔的离子流，并反映在随时间变化的电流记录中。通过分析离子电流在阻断幅度、持续时间和频率方面的调制，纳米孔已应用于单分子水平上DNA、RNA、肽、蛋白质、代谢物和蛋白质-DNA复合物的随机传感和表征。特别是，基于纳米孔的DNA/RNA测序的成功，以相对简单、高通量和无标签的格式刺激了许多潜在的应用。

理想情况下，纳米孔的尺寸应与分析物的尺寸相当，以便分析物的存在产生可测量的高于噪声水平的离子电流振幅变化。纳米孔可以通过多种方式形成，孔径范围很广。生物纳米孔是由蛋白质亚单位、肽甚至DNA支架在脂质双层或嵌段共聚物膜中的自组装形成的。生物纳米孔的化学修饰和基因工程，或引入生物分子来功能化固态纳米孔，可以进一步增强纳米孔与分析物之间的相互作用，提高设备的整体灵敏度和选择性。

纳米孔技术最初是为了对离子和小分子进行随机传感而开发的。随后，许多开发工作都集中在DNA测序上。然而，现在纳米孔的应用已经远远超出了测序，因为该方法已被用于分析许多不同生化系统中的分子异质性和随机过程。首先，纳米孔能够以相对较高的速率逐个连续捕获许多单分子，这使得纳米孔能够在合理的时间范围内在单分子水平上探索大量分子。第二，纳米孔将分析物的结构和化学性质转换为可测量的离子电流信号，甚至实现对映体识别。因此，纳米孔可以很好地应用于分子诊断应用，从而实现核酸、蛋白质或代谢物分析物和其他生物标记物的鉴定。第三，纳米孔为构建仿生系统提供了一个定义明确的支架，涉及生物分子相互作用的复杂网络，成为解开复杂生物过程的平台。第四，化学基团可以在蛋白质纳米孔内空间排列，为位点选择性或区域选择性共价化学提供一个受限的化学环境。该策略已用于设计蛋白质纳米反应器，以监测键断裂和键形成事件。

近日，一组来自世界各地的研究团队在杂志Nature nanotechnology上发表了一篇题为“Nanopore-based technologies beyond DNA sequencing”的综述文章。在这篇综述里，研究团队讨论了DNA测序以外的纳米孔技术的最新进展和该领域的未来轨迹，以及未来十年的机遇和主要挑战。特别介绍了用于蛋白质分析和蛋白质测序的新兴纳米孔方法、单分子共价化学、临床样本的单分子分析以及利用仿生孔分析复杂生物过程的见解。

图片来源：Nature nanotechnology

蛋白质组学的挑战包括识别蛋白质、量化其丰度以及表征其翻译后修饰。

已使用固态和生物纳米孔检测折叠蛋白质。通过分析蛋白质通过固态纳米孔的移位动力学，可以推断出蛋白质的体积、偶极和形状等性质，这表明纳米孔有助于提取蛋白质的一般性质。（图a）。

纳米孔蛋白质组学的理想方法是从头开始的蛋白质测序，其中蛋白质被展开，通过氨基酸在纳米孔中线性移位，单个氨基酸通过特定的电流特征识别。利用生物纳米孔，几个实验室已经观察到肽或拉伸多肽中单个氨基酸的差异。因此，至少一部分氨基酸或翻译后修饰应该可以通过纳米孔电流测量来解决。（图c）另一种方法是使用失活的蛋白酶体，将未折叠蛋白送入蛋白酶体室，并最终通过纳米孔。这两种方法均处于探索阶段，都需要进一步的发展。

除了识别蛋白质外，纳米孔还可用作单分子传感器来表征蛋白质的活性、动力学和构象变化。纳米孔的独特优势之一是能够在单分子水平上以微秒分辨率对天然蛋白质进行取样。在纳米孔酶学的首次实施中，生物纳米孔用于监测酶反应产物的形成。

一种更通用的方法是暂时将蛋白质捕获在生物纳米孔内。然后可以通过纳米孔信号的变化获得构象变化或动力学（图d）。已报道使用生物纳米孔配体诱导一系列蛋白质的构象变化。其中包括配体结合和催化过程中二氢叶酸还原酶（DHFR）的微小构象变化，这在以前的单分子荧光共振能量转移实验中无法观察到。

利用纳米孔进行单蛋白表征。图片来源：Nature nanotechnology

单分子传感通常涉及非共价或共价相互作用。附着在纳米孔内壁上的单个分子的成键和断键事件可以根据其对离子电流的调制进行分析。设计用于包含反应位点的生物纳米孔被称为蛋白质纳米反应器。纳米反应器方法已被用于研究光化学的各个方面，揭示立体化学转化过程，逐步观察聚合过程，并监测一级同位素效应。

必须考虑纳米反应器方法在单分子共价化学方面的优缺点。有利的一面是，不需要标记反应物。虽然纳米反应器方法提供了一个单分子反应轨迹，其中所有步骤都是可见的，但与任何单分子方法一样，中间体的分子识别可能存在问题。

最近，人们的兴趣转向了纳米孔内的环境，特别是受限环境、相邻基团和手性，如何影响化学，尤其是聚合物，以及电泳和电渗如何将反应物驱入和驱出孔隙。为了实现聚合物的化学操纵，可以通过末端蛋白阻滞剂或与内壁的共价连接阻止其通过纳米反应器的移位（图a）。在存在由电泳或电渗施加的拉力时，聚合物将在管状结构内延伸和伸长。

受限体系聚合物化学。图片来源：Nature nanotechnology

纳米孔因其在测序和生物分析应用中的用途而最受关注，但它们也为研究细胞生物学中出现的问题提供了令人兴奋的机会。细胞膜内有各种各样的纳米大小的孔（图a），这些孔充当细胞间分子运输的通道。例如，离子通道和转运体。较大的孔，如核孔复合体（NPC）。

随着固态纳米孔、蛋白质纳米孔工程和DNA纳米技术的最新进展，现在有可能建立人工系统，以在体外重现生物孔的功能。有许多基于纳米孔的工程系统可以作为最小限度的模拟，包括用于实现离子泵、离子通道和pH门控孔。生物纳米孔被设计用于模拟被动或主动的膜转运蛋白。这种仿生孔有很大的潜力来增强我们对复杂生物过程的理解。

一个著名的例子是NPC （~40 nm），调节进出核的所有分子流量（图b）。NPC的中央通道由内在无序蛋白质组成，虽然小分子可以自由通过，但较大的货物（>40 kDa蛋白或信使RNA）被阻断，除非它与核转运受体结合。仿生NPC是在过去十年中发展起来的。用纯化FG Nups网格就足以形成选择性运输屏障；也就是说，它们允许核转运受体有效通过，但阻止其他蛋白质。通过将FG Nups接到固态纳米孔的内壁（图c），可以测量跨仿生纳米孔的选择性传输，离子电流测量提供单分子分辨率。

基于纳米孔的仿生NPC。图片来源：Nature nanotechnology

纳米孔传感技术在临床方法学中的应用带来了新的挑战。首先，临床样本中的目标生物分子（通常是核酸或蛋白质生物标记物）的浓度范围很广，从一些血液致病性感染和循环肿瘤DNA的10−18 M量级到严重急性呼吸综合征（SARS）、流感和其他生物标志物的10−9 M量级。第二，大多数临床样本含有大量可能干扰纳米孔传感器本身的成分（即堵塞纳米孔或导至错误移位事件）。

为了增强分子的特异性并规避背景分子对纳米孔功能的负面影响，已经开发了许多生化分析方法。这些分析涉及样品制备过程中目标分子的最小损失，同时通过背景分子的选择性降解保护纳米孔。例如，固态纳米孔利用DNA连接酶的极高特异性，选择性富集血液样本中与乳腺癌基因（即ERBB2和PIK3Ca）相关的选定循环肿瘤DNA突变。最近，一种基于纳米孔的mRNA表达数字计数的无纯化方法被证明。该方法涉及目标基因的逆转录，然后直接进行背景分子的酶降解，无中间纯化阶段。该方法用于量化mRNA癌症生物标记物，如MACC1，以及SARS-CoV-2临床样本的无PCR检测，可能显示出比金标准定量PCR反转录法更高的准确性。

临床样品的纳米孔传感并不局限于核酸和蛋白质。最近，研究发现，用于测量生物纳米孔内蛋白质构象变化的方法也可以用于直接从体液（血液、汗液、尿液和唾液）中检测代谢物的浓度，例如葡萄糖和天冬酰胺或维生素B1。

这说明了纳米孔传感在未来复杂生物流体表征方面具有巨大潜力，通常涉及多种生物标记物。

纳米孔传感用于生物样品和临床诊断。图片来源：Nature nanotechnology

本综述概述了DNA测序以外的各种纳米孔研究方向和应用。在过去二十年中取得了巨大进展。纳米孔已经成为包括化学、生物物理和纳米科学在内的多学科中必不可少的单分子工具。本综述展示了纳米孔在促进新知识和新技术方面具有巨大潜力的四个研究领域，包括蛋白结构和序列的表征，单分子化学，用于模拟生物系统的合成纳米孔，以及识别和量化生物标志物。然而，在实现纳米孔技术的全部潜力之前，仍有一些挑战需要克服。例如，为了揭示单个生物聚合物（例如，蛋白质或多糖）的确切化学成分，有必要提高传感精度和时间分辨率。纳米孔很可能需要裁剪，因为传感区域的体积应与生物聚合物的单个单元大小相当。更重要的是，纳米孔应该对聚合物单个单元的化学或物理性质最敏感，为每个单元产生可区分的离子电流特征。

基于纳米孔的生物医学应用已经发展到DNA测序和表观遗传修饰分析之外，现在用于检测生物流体和其他生物样本中的分子生物标记物（蛋白质、代谢物和核酸）。鉴于纳米孔应用的快速增长，纳米孔技术很可能成为单分子体外诊断的一项重要技术。

DNA测序以外的纳米孔技术。图片来源：Nature nanobiotechnology