综述！外泌体蛋白在癌症诊断、预后和治疗中的最新作用

外泌体来自多囊泡体（MVB），在电子显微镜下呈杯状，直径为50至150 纳米。外泌体是由各种细胞自然分泌的，通常在体液中检测到，包括血液、尿液、腹水和唾液。外泌体“货物”包括核酸、蛋白质、脂类、酶和指示母细胞生理状况的代谢物。外泌体被认为通过与细胞膜直接融合、内吞途径和配体-受体相互作用在细胞-细胞通信中发挥作用。

肿瘤衍生（TD）外泌体由肿瘤细胞释放，并携带能反映亲代肿瘤细胞特征的物质。因此，外泌体可作为肿瘤诊断标记物。作为微环境中肿瘤细胞与非肿瘤细胞之间的重要通讯形式，外泌体在肿瘤发展的不同阶段发挥着重要作用，包括肿瘤相关免疫调节、微环境重建、血管生成、侵袭和远处转移。在不同类型和不同阶段的癌症中，外泌体蛋白的表达谱往往存在显著差异，这表明这些蛋白与癌症的发展和进展密切相关。此外，TD外泌体的其他功能也不容忽视，包括参与限制免疫调节和增强化疗耐药性，可能促进原发性肿瘤生长和转移。

近日，来自中国的研究团队在杂志Experimental & Molecular Medicine上发表了一篇题为“The updated role of exosomal proteins in the diagnosis, prognosis, and treatment of cancer”的综述文章。在这篇综述中，研究团队总结了外泌体蛋白对肿瘤发展的影响，强调了外泌体蛋白质在各种癌症中的诊断和预后作用，并说明了外泌体蛋白质在癌症治疗中的潜在应用。本综述旨在全面了解外泌体蛋白的生物学机制和临床价值，加深对外泌体蛋白在肿瘤发生和癌症进展中的作用的理解，并为进一步的应用和研究提供建议。

图片来源：Experimental & Molecular Medicine

外泌体蛋白质要么封装在内腔内，要么嵌入外泌体表面，这使得基于表面生物标记物的外泌体亚型分类能够在不破坏其结构的情况下进行。由经历病理过程的细胞分泌的外泌体具有不同的成分，可作为其状态的标记。

与其他外泌体货物相比，外泌体蛋白质在癌症诊断方面具有以下优势：（1）外泌体蛋白在外泌体中稳定，半衰期长。此外，外泌体内的蛋白质可以直接作用于靶细胞，而核酸必须在发挥活性之前转录或翻译。因此，外泌体蛋白质的定量和定性数据可以提供比其他货物更准确的信息。（2） 与其他外泌体货物相比，外泌体表面蛋白可以在一个相对简单的分离程序后在较小的样本量中检测到。外泌体蛋白质可以提供丰富、稳定、敏感的和独特的信息。（3） 由于基于质谱的检测技术的进步以及数据收集和分析方法的不断优化，比较蛋白质组学的蛋白质覆盖率和灵敏度都有所提高，癌症患者尿液中的特异性外泌体蛋白可以检测到。蛋白质组学工具在外泌体研究中分析翻译后修饰的应用也增加了外泌体蛋白质组学数据在癌症发病机制、功能和疾病关联方面的深度。

外泌体表面蛋白及其作用。 图片来源：Experimental & Molecular Medicine

外泌体蛋白与血管生成、上皮-间质转化、肿瘤微环境和耐药性

携带VEGF的外泌体可能对早期肿瘤血管生成至关重要。研究表明外泌体蛋白与血管生成和血管通透性相关，从而促进癌症进展。

在癌症中，上皮-间充质转化（EMT）是上皮细胞转化为间充质细胞的一个特殊过程。间充质细胞源性外泌体的蛋白质组分析显示，一些上皮生物标记物（如E-cadherin和EpCAM）减少，而间充质生物标记物（如vimentin）和蛋白酶（如MMP-1）增加。因此，需要彻底认识外泌体蛋白在EMT中的功能。

肿瘤细胞可以与肿瘤微环境（TME）内的各种类型的非癌细胞相互作用。作为细胞外环境的组成部分，组织源性外泌体在TME中启动ECM重塑的能力对肿瘤细胞的存活至关重要。外泌体蛋白除了对ECM重塑的影响外，还可以通过免疫调节影响TME。综上所述，外泌体蛋白对改变微环境的免疫调节有多方面的影响。

外泌体介导的多药耐药也是癌症发展的一个重要机制。其基本机制涉及外泌体介导的钙依赖性蛋白激酶激活和Raf/MEK/ERK级联。除此之外，外泌体还可以通过控制P-糖蛋白的表达将耐药多药耐药性传递给对敏感个体。外泌体蛋白被认为是耐药的重要介导物，进一步的研究表明外泌体蛋白在癌症治疗中的应用。

外泌体蛋白在癌症生物学中的作用。 图片来源：Experimental & Molecular Medicine

尽管外泌体的内容不断被重新定义，外泌体载体的优势和独特性已证明其作为肿瘤标记物的巨大潜力。位于外泌体表面或膜内的蛋白质也可以用作癌症生物标记物。与其他类型的外泌体货物（DNA、mRNA、miRNA、circRNA、lncRNA和代谢物）相比，蛋白质可以提供丰富、稳定、敏感和独特的信息。外泌体蛋白被报道为多种癌症的特异性诊断和预后因素，包括乳腺癌、泌尿系统癌症、肺癌、胃癌、肝癌、结直肠癌、卵巢癌、甲状腺癌和胰腺癌（如下图）。

多种类型人类癌症的外泌体蛋白生物标记物。图片来源：Experimental & Molecular Medicine

在世界范围内，乳腺癌已成为女性中最常见的癌症。研究证明，ADAM10、金属蛋白酶、CD9、Annexin‐
和HSP70在乳腺癌患者胸腔积液或血清中分离的外泌体中富集。Moon等人提出了fibronectin和Del-1在乳腺癌细胞源性外泌体中的诊断价值，AUC为0.961，敏感性为94.70%，特异性为86.36%。此外，血清中外泌体survivin‐B的独特表达模式被认为是早期乳腺癌的标志。与5年无病对照组相比，这些患者的血清外泌体survivin-2B水平显著升高。然而，需要研究阐明外泌体蛋白是否可以作为乳腺癌的非侵入性和有效诊断标记物。

许多研究集中于膀胱癌和前列腺癌细胞源性外泌体的蛋白质成分。Wang等人对来自HT1376膀胱癌细胞的外泌体进行了蛋白质组学研究。MS共检测到353个外泌体蛋白，并检测到一些外泌体表面蛋白的高表达，包括MUC1、整合素β1、整合素α6、CD36、CD44、CD10、5T4、basigin和CD73。Øverbye等人研究了16名前列腺癌患者和15名健康对照者的尿液外泌体蛋白。在两个队列中共检测到246个差异表达蛋白，其中17个在100%特异性下的灵敏度高于60%，TM256的灵敏度最高（94%）。这些研究证明了尿液外泌体在发现蛋白组生物标记物用于无创诊断泌尿系肿瘤方面的价值。

外泌体蛋白对非小细胞肺癌具有特异性诊断价值。Wu等人报道，从非小细胞肺癌活检中获得的外泌体中，80%为EGFR阳性，而慢性炎症性肺组织中为2%。Li等人鉴定了正常支气管上皮细胞和非小细胞肺癌细胞外泌体中差异表达的蛋白质（包括EGFR、GRB2和SRC），与细胞粘附、ECM和蛋白酶相关的一些蛋白质在NSCLC细胞源性外泌体中高度表达。Park等人从非小细胞肺癌患者的恶性胸腔积液中分离出高纯度外泌体，并鉴定出潜在的诊断标记物，包括EGFR、K-Ras、basigin、 carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 6、claudin1、claudin 3和RAB家族蛋白。综上所述，多蛋白模型可以对不同疾病阶段和组织学类型的肺癌患者进行分类，外泌体蛋白具有作为肺癌诊断标记物的潜力。

先前的研究已经确定了结直肠癌（CRC）衍生外泌体的一些蛋白质生物标记物，如CEA、EGFR、MAPK4、PCNA和keratin 18。CRC细胞源性外泌体的蛋白质组分析显示了许多转移因子的特异性表达，如肝细胞生长因子受体、S100A8、S100A9和tenascin C。最近，转移性CRC细胞源性外泌体的磷酸化蛋白组学分析显示，磷酸化蛋白的水平明显高于非转移性CRC-细胞源性的外泌体，这表明外泌体也可能将磷酸化蛋白转移到靶细胞。因此，外泌体蛋白在CRC诊断和治疗中的潜在应用有待进一步研究。

一些外泌体蛋白参与了GC的发展。从GC患者血清中提取的外泌体中检测到一种免疫抑制细胞因子TGF-β1。EGFR存在于GC细胞衍生的外泌体中，并被输送至肝脏，EGFR随后抑制miR-26a/b的表达，并进一步增加肝细胞生长因子的表达，促进GC细胞肝转移适当环境的形成。Yoon等人报告称，健康对照组的血清GKN1水平（中位数：6.34 ng/μL）比GC患者（中位数：3.48 ng/μL)显著升高。GC的敏感性和特异性分别为91.2%和96.0%。此外，血清GKN1水平可以将GC患者与结直肠癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌和前列腺癌患者区分开来，AUC值大于0.94，表明其作为GC特异性诊断生物标记物的价值。这些研究表明，外泌体蛋白是GC的潜在诊断和预后标记物。

Arbelaiz等人评估了HCC患者和健康人群血清中外泌体的蛋白质水平，并注意到HCC患者中G3BP和PIGR水平显著升高，且对肝癌的预测效果高于AFP。Fu等人报道，HCC细胞源性外泌体含有SMAD3蛋白，可以促进HCC细胞的粘附。SMAD3阳性外泌体的数量与HCC分期和病理分级呈正相关，与HCC患者术后无病生存率呈负相关。Wang等人报道，肝癌细胞源性外泌体中14-3-3蛋白水平增加，且高14-3-3蛋白水平与较大的肿瘤大小、较差的肿瘤分化和更晚期的TNM分期有关。尽管有几项研究调查了外泌体蛋白与肝癌之间的关系，但对外泌体影响肝癌形成的机制仍缺乏深入的研究。

Runz等人的一项研究发现CD24和EpCAM是卵巢癌细胞系和恶性腹水的外泌体货物。在32/63名OC患者以及1/50名健康对照的血液中检测到Claudin 4阳性外泌体，这表明它们有可能成为OC的高度敏感和特异性指标。此外，使用磁性纳米珠进行外泌体检测表明，OC患者的血清中含有大量表达HER2的外泌体。需要进一步分析以表征和区分外泌体的种群，并探索外泌体蛋白在体内的生物学功能。

Luo D等人发现，在有淋巴结转移的TC患者中，一些外泌体蛋白（SRC、TLN1、ITGB2和CAPNS1）的水平与EMT相关。Caruso等人报道，与癌旁甲状腺组织和良性甲状腺肿相比，TC组织中的HSP蛋白水平升高。术前TC患者外泌体HSP蛋白水平显著高于良性甲状腺肿患者或术后TC患者。这些结果表明，外泌体蛋白的应用可大大有助于TC的诊断和临床监测。

外泌体蛋白在PC诊断方面也有潜在的应用价值。Buscail等人观察到GPC1在PC细胞衍生的外泌体中富集。GPC1阳性外泌体显示出很高的准确性，AUC为1.0，敏感性为100%，特异性为100%。外泌体GPC1诊断PC的敏感性和特异性高于CA 19-9。MIFs在PC细胞源性外泌体中过度表达，并且其抑制活性可以促进PC的发生和转移。与无PC进展的患者相比，转移性PC患者的MIFs显著增加，表明外泌体MIFs在转移中起着重要作用，可能是肝转移的预测标志物。最近的一项研究报道，外泌体整合素α6β4和α6β1与PC的肺转移相关，而整合素αvβ5与肝转移相关。因此，研究外泌体蛋白在PC中的作用很重要。

在发现外泌体参与细胞间通讯之前，外泌体被认为在癌症治疗中发挥作用。外泌体被设计成携带靶向配体和刺激反应因子。外泌体可以通过两种不同的方式进行修饰，一种是通过内部修饰（外泌体内的蛋白质货物被修饰），另一种是经过表面修饰（外生体表面蛋白质被修饰）。

含有所需蛋白以防止肿瘤进展的工程外泌体是外泌体在癌症治疗中的潜在应用。一项研究报告称，携带阿霉素的工程外泌体增强了肿瘤靶向性和抗肿瘤活性。在另一项研究中，外泌体的母细胞被设计成表达融合到αv整合素特异性iRGD肽的Lamp2b，它们在前列腺癌、乳腺癌、宫颈癌和胰腺癌中具有足够的肿瘤靶向性。

外泌体的免疫功能可能使其用作癌症免疫治疗的特定药物运输工具或疫苗。癌症疫苗将肿瘤抗原呈递给免疫细胞，从而激活抗肿瘤免疫反应。由于TD外泌体携带许多肿瘤抗原，它们参与抗原呈递，似乎是一种可能的癌症疫苗。肿瘤细胞源性外泌体不需要MHC单倍型匹配。因此，有可能创造出无细胞抗癌疫苗，而不需要为每个患者设计。此外，外泌体携带的肿瘤抗原对一种类型的癌症没有特异性，因此它们可能能够预防多种癌症。目前的癌症药物和治疗有副作用和长期并发症，许多患者最终会产生多药耐药性。因此，外泌体蛋白具有治疗各种癌症的潜力，这在许多体外和体内研究中都表明了它们的抗肿瘤作用。

外泌体的内部和表面蛋白质修饰。 图片来源：Experimental & Molecular Medicine

近年来，随着蛋白质组学分析的普及，从细胞系或体液中获得的外泌体蛋白的分泌和功能已经被揭示，它们在预测肿瘤发展中的作用也越来越受到关注。外泌体表面蛋白为外泌体生物发生、分泌、蛋白质与蛋白质相互作用和受体细胞靶向机制提供线索。外泌体蛋白在癌症的许多方面发挥着重要作用，包括EMT、ECM重塑、血管生成、肿瘤相关免疫调节、转移前行为和耐药性。

体液中的外泌体选择性地富含癌症病变的特征蛋白。使用固定在芯片上的已知癌症表面标记抗体，检测到了外泌体表面生物标记，表明外泌体表面标记的识别可以提供肿瘤的生物学信息。将确定新的生物标记物，并开发更敏感的方法用于早期癌症诊断、预后和治疗评估。然而，与RNA分析相比，外泌体蛋白质组分析的挑战在于缺乏蛋白质载体的扩增程序。此外，为了有效地整合不同研究团队的结果，并转化外泌体在临床上使用的可行性，应该规范外泌体的分离和鉴定方法。

总之，展望技术进步，外泌体蛋白含量或蛋白质组图谱不仅可以为癌症患者提供诊断和预后线索，还可以为未来癌症治疗提供选择。