Bin仔整理 传统获取肿瘤患者组织样本的活检方法主要为穿刺活检，穿刺活检的局限性在于：穿刺活检的创伤大、重复取样不方便、穿刺自身的临床风险等。传统活检的局限性限制肿瘤精准化医疗的进程，包括无法便利地实现肿瘤的实时监测、无法实现肿瘤的早期诊断等。液体活检是指从血液中捕捉自由游走的癌细胞或癌细胞中的DNA，以获得关于小肿瘤或潜藏肿瘤的信息，从而对癌症等疾病做出诊断，如果配合传统检测技术，更具有临床指导意义。 液体活检目前包括循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cells，CTCs）、循环肿瘤DNA（ctDNA）碎片、循环RNA（Circulating RNA）和外泌体（携带有细胞来源相关的多种蛋白质、脂类、DNA、RNA等）等主流技术。相比于传统检测手段，液体活检具有微创、可重复进行的特点，可实时监测肿瘤治疗的疗效和肿瘤的进展。
循环肿瘤细胞是外周血中所有肿瘤细胞的统称，因自发或者诊疗手段从实体瘤肿瘤病灶（原发灶、转移灶）脱落进入外周血循环。大量临床研究表明，对CTC数量进行跟踪、监控有助于癌症早期诊断，预后判断和药效评估。ctDNA是肿瘤细胞体细胞DNA经脱落或者当细胞凋亡后释放进入循环系统，是特征性的肿瘤生物标志物。循环肿瘤DNA检测技术近年来正逐渐成为国际上具有重大潜力的肿瘤诊断新技术。 1 专利发展历程 同时，许多用于CTCs的检测技术得到了开发，例如密度梯度分离技术、基于尺寸的过滤技术、基于免疫的分离技术、免疫磁分离技术(CN107858144)等，通过细胞的物理性质（例如大小、密度、电荷、变形性等）(JP6535050、US20110294206)或生物特性将其与正常细胞分开。 以CTC、cfDNA、外泌体等肿瘤液体活检，被列为2015年十大突破技术之一，进一步加速了专利布局的热潮。就循环肿瘤细胞的分析技术而言，肿瘤分子标志物的检测是基础的方法，但是CTC单细胞基因组测序能够读取单个循环肿瘤细胞特异性信息，发展潜力巨大。对于异质性很强的肿瘤，CTC相比组织单一取材，更能全面反映肿瘤组织的异质性，更适合于评估肿瘤的分子特征及评估肿瘤进展。因此，一些特定的标志物相关专利得到了布局（例如US10234447、EP2529030等）。常见的循环肿瘤细胞分子标志物及其检测应用如下图1所示。
图1、常见的循环肿瘤细胞分子标志物及其检测应用 （Bin仔绘制） 2 专利竞争格局
图2、循环肿瘤细胞分离和鉴定的专利权人技术分类 （Bin仔绘制） 3 专利布局方向
图3、常见的循环肿瘤细胞分离方法及其优缺点 （Bin仔绘制） 就目前的循环肿瘤细胞的捕获和分离技术而言，细胞表面标志物有很多种，如根据标志物类型来分，有上皮细胞标志物（上皮细胞黏附因子和细胞角蛋白）、器官特异性标志物、上皮细胞转化(EMT)标志物；根据抗体类型来分，有单一抗体、“鸡尾酒”、复合物（抗体-多核酸复合物、生物素标记的抗体、氨基化树状分子）；根据策略类型来分，有免疫磁珠、免疫细胞化学、微流控等（如图4所示）。
图4、循环肿瘤细胞的捕获和分离技术原理分类 （Bin仔绘制） 尽管基于上皮细胞标志物的捕获技术仍然是“金标准”，但是很难找到灵敏性和特异性兼顾的生物标志物，因而假阳性和假阴性的局限仍然难以避免。可能用于循环肿瘤细胞检测的常见分子标志物如图5所示。
图5、可能用于循环肿瘤细胞检测的常见分子标志物 （Bin仔绘制） 3、循环肿瘤RNA的检测 存在于血清、血浆、尿液、胸腹水、脑脊液等体液中的循环肿瘤RNA(circulating cell-free RNA, cfRNA)，也已逐渐成为新兴的液体活检分子标记。与传统分子诊断技术相比，基于cfRNA的液体活检能够克服肿瘤的异质性，更全面地反映肿瘤特性，并具有非侵入性，便于多次取样，可对患者进行实时监控。目前在基因融合突变检测中常用的染色体显带技术、荧光原位杂交、免疫组化只能用于检测染色体或组织细胞(无法适用于cfRNA)，荧光定量PCR需要标准曲线确定待测样本的拷贝数（无法检测到cfRNA中的稀有突变)，高通量测序方法的读长较短，测序结果并不精准。因而，针对样本丰度低、半衰期短的cfRNA，需要开发新的基因融合突变检测方法。 4、作为生物标志物的广泛运用 肿瘤循环细胞作为生物标志物，在筛查、药物评价、预后等方面也有着广泛的应用前景（如图6所示），未来也有较广阔的专利布局空间。
图6、循环肿瘤细胞作为生物标志物的研究与应用 （Bin仔绘制） 5、样本采集来源的拓展 除了血液外，粪便既含有脱落的正常结直肠上皮细胞和游离的DNA，也含有从结直肠癌上脱落的特别浆细胞和肿瘤DNA。由于肠道是碱性环境（有利于DNA保存），从粪便中提取的DNA作为无创性结直肠肿瘤标志物，在研究中得到了应用。 |
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