本研究方案代表了一个标准的捕获或ELISA夹心法的例子，使用生物素化的检测抗体和链霉亲和素-HRP间接法系统，使用常用的试剂和TMB（四甲基苯）底物。
1、所需材料 1.1、硬件设备 ➤ 透明的96孔板； ➤ 带一次性塑料吸头的多通道精密移液器； ➤ 配备有检测底物的平板阅读器或发光仪。 1.2、试剂
2、标准品的制备 通常情况下，标准曲线的浓度可以从0到1000 pg/mL，但也可能高达3000 pg/mL，这取决于样品中抗原的预测量和标准蛋白的数量。 通常情况下，使用标准稀释剂从储备液中制备标准蛋白的2倍或3倍稀释液。在制备蛋白质标准品的连续稀释液时，每次稀释后要使用新的吸头。 3、样品的制备 如果样品中的抗原浓度可能超过标准曲线的最高点（即 > 1,000 pg/mL），则使用标准稀释液制备一个或多个样品稀释液。 4、实验程序 重点：在任何时候都不要让平板干燥。 1. 将捕获抗体稀释到适当的浓度，使每孔有足够的体积为50 ~ 100 μL。 2. 将稀释后的捕获抗体加入板中，盖上盖子，在室温下孵育2小时。 3. 取出溶液，用每孔200 μL的洗涤缓冲液在摇动平台上洗板3×5分钟。 4. 每孔加入300 μL封闭缓冲液，盖上板子，室温下孵育1小时。可以在4℃下封闭过夜。 5. 准备好样品和标准品。每孔的体积应与步骤1中使用的捕获抗体相同。 6. 移除封闭缓冲液，加入样品和标准品。盖上板子，在室温下孵育1小时。 7. 取出溶液，用每孔200 μL的洗涤缓冲液在摇动平台上洗板3×5分钟。 8. 将生物素化的检测抗体稀释到适当的浓度。每孔的体积应与步骤1中使用的捕获抗体相同。 9. 将稀释后的检测抗体加入板中，盖上盖子，在室温下孵育1小时。 10. 取出溶液，用每孔200 μL的洗涤缓冲液在摇动平台上洗板3×5分钟。 11. 将酶结合物稀释到适当的浓度。每孔的体积应与步骤1中使用的捕获抗体相同。 12. 将稀释后的酶结合物加入板中，盖上盖子，在室温下孵育1小时。 13. 取出溶液，用每孔200 μL的洗涤缓冲液在摇动平台上洗板6×5分钟。 14. 将底物溶液加入板中。每孔的体积应与步骤1中使用的捕获抗体相同。 15. 在室温下孵育平板，直到达到理想的颜色强度。理想情况下，标准品会产生一个清晰的梯度。 16. 加入等量的终止液来停止反应。 17. 如果使用TMB，在450 nm处测量吸光度。对于其他底物，使用适当的检测技术。 |
/3 
浙公网安备33010802005999号 
