技术｜各种不同的ELISA检测技术

包被抗原在两种主要技术中有所不同。

在传统的（直接涂布）ELISA中，抗原通过被动吸附直接附着在板上，通常使用pH > 9的碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液。在碱性条件下，大多数但不是所有的蛋白质都能与微孔板的聚苯乙烯表面紧密结合。

然而，如果抗原的含量很低或不能很好地粘附在塑料上，那么可以使用另一种夹层或捕获ELISA。

在捕获（间接包被）ELISA中，抗原特异性抗体被吸附在塑料上，在与抗原样品孵化时，它又与抗原结合并包被下来。抗体的附着通常使用pH值大于9的碳酸/碳酸氢盐缓冲液来实现，或者在极少数情况下使用预激活板来实现更直接的附着方法。

当使用复杂的蛋白质样品时，ELISAs夹心法已经变得非常流行，因为只有特定的抗原被包被，而不是整个蛋白质样品被包被。包被的抗原越多，检测的潜在灵敏度就越高。

ELISAs夹心法需要两种不同的抗体与抗原特异性结合（每种抗体与不同的表位反应）。一阶抗体（结合在平板上）被称为捕获抗体或包被抗体，而二阶抗体检测包被的抗原，被称为检测抗体。

这样的抗体被称为「匹配对」；它们必须经过验证才能结合使用，因为它们必须不与抗原竞争结合才能获得准确的结果。可以使用单克隆和多克隆抗体的组合；更常见的是使用单克隆作为包被抗体，多克隆作为检测抗体。

ELISAs夹心法有时比传统ELISAs需要更多的优化，但通常信噪比（S:N）更高。

直接法包括用酶或替代信号分子（如荧光体）标记检测抗体。间接法包括一个额外的探针步骤，使用另一个标记有可检测标签的抗体或链霉菌素。这个额外的探针被称为二阶抗体，因为它的唯一目的是通过与检测（一阶）抗体结合来传递可测量的信号标签。

直接法通常比间接法更快，而且也消除了二阶抗体与包被抗体交叉反应的潜在背景信号。然而，即使在最好的情况下，直接法也不能提供从使用二阶抗体或Avidin/生物素系统获得的信号放大。

因此，直接法通常不如间接法灵敏，最好只在目标物相对丰富时使用。

生物素是一种小的（MW 244）维生素分子，很容易被修饰，因此它可以被化学地连接到蛋白质、抗体和其他感兴趣的生物分子探针上。

Avidin和Streptavidin是源于不同来源的蛋白质，但在与生物素分子非常强烈和特异地结合方面具有几乎相同的功能。此后在本文中，「Avidin」和「链霉菌素」将互换使用，指这些生物素结合蛋白中的任何一种。Avidin-生物素亲和系统经常被用于设计ELISA的标记和检测系统。

间接法的一个常见的适应性是使用Avidin-生物素化学方法放大信号，有两种方法：

➤   第一种方法是使用生物素化的检测抗体，使用与辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）共轭的Avidin或链霉菌素蛋白进行探测。

➤   第二种方法也采用了生物素化的检测抗体，但它是用预先孵化的Avidin和生物素化的酶的混合物进行检测，这一过程被称为 「Avidin-生物素复合物」（ABC）信号放大。

这些方法的信号放大通过两种机制发生：

首先，生物素化（生物素标记）通常会使每个抗体分子产生多个生物素标签，从而使一个以上的链霉蛋白分子与每个抗体结合。由于Avidin型蛋白是四聚体，每个分子有四个生物素结合位点，这有助于结合。

其次，用酶标记链霉菌素分子或使用链霉菌素和生物素化酶的预孵化混合物的过程导至结合物具有一个以上的酶。这种多重标记的综合效果是增加最终免疫复合物中酶分子的数量。这增加了适当底物的催化作用，与传统的酶标记的二阶抗体相比，给出了更强的信号。

图2 | ABC系统可实现的信号放大示意图

相对而言，最近在可见光和红外线范围内稳定的荧光基团数量的扩大，使荧光信号检测成为ELISA应用中一个有吸引力的选择。这种方法在进行多重阵列时很常见，因为可以用连接到不同荧光基团的抗体同时检测一种以上的抗原。

在荧光检测中，检测抗体被直接标记，或者二阶抗体（或偶尔是Avidin）被标记用于间接法。

当使用标记的二阶抗体进行复用时，必须使用来自不同物种的检测抗体，以便区分不同的信号。检测极限通常在100 pg/孔左右，其灵敏度低于比色法或化学发光法。

图3 | 多重阵列ELISA的示意图，通过使用荧光使之成为可能

在这种情况下，12种不同的捕获抗体以印刷点阵列的形式涂在玻璃片上。每个抗体捕获不同的分析物，并由其匹配的检测抗体检测，该抗体是生物素化的。最后，所有的斑点都通过荧光标记的链霉菌素结合物（本例中是Thermo Scientific DyLight™ 649荧光基团）。

在ELISA应用中通常使用两种酶。

碱性磷酸酶（AP）是一种大型的酶，用于少数的检测。它的大小（140 KDa）使它很难将超过一到两个分子的酶连接到每个分子的抗体或阿维丁上，这就限制了可以产生的信号量。除非正确储存和处理，否则AP也容易出现稳定性问题。

辣根过氧化物酶（HRP）是一种更常用的酶。它的小尺寸（40KDa）允许更多的分子与抗体或Avidin偶联，这可以促进信号的产生。HRP是大多数研究人员进行ELISAs的首选酶，可与各种底物一起使用（见下文），其中大多数底物比AP等价物更灵敏。

酶信号的产生需要底物的催化作用，产生有色或荧光化合物或化学发光（可见光）。信号的测量是使用分光光度板阅读器、带有适当过滤器的荧光仪或设置为读取总光输出的发光仪。

下面将讨论每种类型的底物：

比色底物形成一种可溶性的彩色产品，相对于每个孔中存在的酶的数量，它随着时间的推移而积累。当达到所需的颜色强度时，可以直接测量产物的吸光度，或者在某些情况下，加入终止液，为检测提供一个包被的终点。辣根过氧化物酶（TMB、OPD、ABTS）和碱性磷酸酶（PNPP）都有比色底物。

化学荧光检测也是以酶为基础的，但生成的产物是荧光的而不是比色的。信号是用带有适当的激发和发射过滤器的荧光仪测量的。化学荧光反应在动力学检测中是随着时间的推移进行测量的，或者使用停止液停止，以便直接测量。

化学发光是一种化学反应，产生的能量以光的形式释放。大多数化学发光底物是依赖于HRP的，尽管有一些AP等价物可用。最常见的方法是在有HRP和过氧化物缓冲液的情况下使用鲁米诺。

鲁米诺被氧化并形成一个激发态产物，当它衰减到基态时就会发光。发光只发生在酶-底物反应过程中，因此当底物耗尽时，信号就停止了。通常认为化学发光检测比比色计检测更灵敏。