EuroGentest是一项欧洲倡议，旨在促进全欧洲准确、可靠和高质量的基因诊断。2016年，EuroGentest发布了经欧洲人类遗传学学会（ESHG）认可的指南，用于罕见遗传病的诊断性下一代测序（NGS）应用。这些先前的建议侧重于全外显子组测序（WES）和检测小种系变异体（单核苷酸变异体（SNV）和插入/缺失（INDEL））的靶向（基因面板）测序，涉及诊断基因组分析的不同方面。 外显子组仅占整个基因组的1-2%，因此WES需要特定的富集方法来扩增外显子组进行测序。这通常限制在约99%的外显子组被富集，这种不均匀的覆盖可能会影响拷贝数变异（CNV）检测。此外，在WES诊断中，其他结构变体（SV）如倒位或调节区或内含子区域的变体通常会被遗漏。考虑到这些局限性，在所有疾病实体中，有5-50%的患者可以检测到潜在的疾病变体。WGS原则上允许检测外显子组以外的疾病相关基因组变体，如DNA结构改变、内含子变体、非编码区变体或重复扩增。诊断NGS代表了一种新颖、独特的诊断工具，它以基因为目标，超越编码区，并允许阐明已建立和新的非编码基因组疾病。 近日，在European Jounal of human genetics杂志上发表了一篇题为“Recommendations for whole genome sequencing in diagnostics for rare diseases”的文章，文章指出，在WGS工作中审查了2016年NGS应用指南中的所有38项声明，并进行了更新。更新后的建议现在由44份原始、更新和新的声明组成。这些建议涵盖了从评估和建立诊断性NGS应用的基本原理到NGS结果报告的各个方面，包括实验室程序和生物信息学管道不同方面的质量控制、变体解释和数据库。提供NGS诊断的必要条件当然是其临床实用性、使用最先进的测序技术、诊断路线（即在实验室中针对特定疾病进行基因测试的路线）和变异分析，以及在诊断环境中生成报告。 一般性建议 WGS技术和应用在不断变化，并且仍在改进。这不应妨碍在诊断中实施WGS，然而，在临床诊断环境中实施之前，该测试需要充分验证。 ●建议1：建议在诊断环境中引入WGS分析，以提高质量、效率和/或诊断产量。 ●建议2：罕见疾病和癌症的诊断工作组（以及其他基因检测方法）只能在经认可的实验室进行。 ●建议3：未经可接受的试验验证，不应将NGS转移到临床实践中。 ●建议4：向患者确认、解释和传达在研究环境中获得的结果前，应该在诊断实验室对（最好）独立样本进行重新测试。 诊断路线 一般来说，诊断路线应选择最有效诊断策略来实现分子诊断（时间和成本）。虽然WGS（和WES）越来越多地被作为一级诊断测试来实施，但临床医生应该意识到可能有更有效的特定疾病诊断测试。 ●建议5：实验室应向临床医生提供信息，以确认基因测试的变异类型。 ●建议6：应考虑WGS的局限性，并将其告知临床医生。 ●建议7：出于诊断目的，应仅报告与疾病明确相关的基因。一份独立的研究报告可能会列出功能未知的基因变体。 ●建议8：诊断测试应针对回答临床问题。建议最好分析一个（或多个）基因面板，并使用过滤策略，并对经常由从头变异引起的疾病使用三组。 ●建议9：对于导至单基因疾病的基因变体的解释，应使用“5层分类系统”。 ●建议10：大型CNV应使用包括细胞基因组畸变在内的数据库进行解释。 ●建议11：建议仅当外显子组外的变异（可能）具有致病性时，才分析和报告这些变异。如果后续研究可以提供更多致病性信息，才需报告VUS（variants of uncertain significance）。 ●建议12：对于变异的解释，有必要拥有患者的临床信息，最好是以标准化的术语，如HPO。 ●建议13：诊断实验室必须实施/使用结构化数据库为所有分类变体进行最新注释。。 ●建议14：报告的变异应通过将其提交给联邦、区域、国家和/或国际数据库来共享，实验室遗传学家和研究人员可以访问这些数据库。 生物信息学 生物信息学管道被定义为从原始数据分析到变体注释所使用的所有软件。还对数据格式、存储和验证程序提出了建议。 ●建议15：建议使用最新注释的参考基因组版本。 ●建议16：应使用标准数据格式。 ●建议17：生物信息学管道必须针对所使用的技术平台进行定制。 ●建议18：建议制定和定义一个协议，以使用于变体识别和变体注释的生物信息学工具保持最新。 ●建议19：参考样品应用于生物信息学工具的验证和标准化。 ●建议20：诊断实验室必须定期使用标准数据集验证生物信息学管道的所有部分（公共领域工具或商业软件包），并在实施相关变更（新版本）时进行验证。 ●建议21：应采用质量参数来监测分析过程（过程控制）和测量所用技术的性能。对于编码区域，一般数据质量应至少与WES数据的质量相似。应准确描述诊断程序中使用的所有NGS质量指标，最好将其存储在数据库中。 ●建议22：生物信息学管道应针对所有可报告的变异类型进行验证，至少包括SNV、小型插入缺失和CNV。 ●建议23：应对所有WGS变体进行注释。 ●建议24：建议在内部数据库中记录变体频率。 ●建议25：诊断实验室应实施长期存储所有相关数据集的协议。 质量评估 内部验证和测试性能比较旨在确保产品的结果满足用户的操作需求。它是关于测试/方法的性能和使用，不应与变体的验证/确认混淆。 ●建议26：应报告的范围，即可以生成可靠识别的临床目标部分，必须在测试开发期间定义，并应提供给临床医生。 ●建议27：如果对来自不同组织类型（如血液和唾液）的DNA进行诊断性测试，则应分别对每种组织类型的湿和干实验室程序进行验证。 ●建议28：每当对试验进行重大更改时，必须检查质量参数，并且必须重新运行一组验证样品，作为验证的一部分。 ●建议29：应在分析评估期间处理样品跟踪和安装barcode以识别样品，并将其纳入平台验证。 ● 建议30：符合预定义质量指标的变体不需要第二种技术进行确认。 伦理考虑 WGS的实施增加了检测到除初始临床问题外的易感疾病变体的可能性。 ●建议31：实验室应该有一个明确定义的协议，用于在启动测试之前处理未经请求的发现。 ●建议32：临床医生应在临床WGS之前提供遗传咨询并获得知情同意。 ●建议33：实验室应预测因传播未经请求的调查结果而可能进行的后续研究。 ●建议34：除非明确要求或为质量保证活动，否则实验室不会系统地重新分析数据并报告新发现。 ●建议35：诊断测试的结果，特别是通过分析整个基因组的结果，可能不是决定性的，但可能会产生假设。 ●建议36：只有在获得充分知情同意的情况下，WGS数据才能用于研究目的。 报告 基因检测报告应为临床问题提供清晰、简洁、准确、充分解释和权威的答案。 ●建议37：对于每个NGS试验，实验室必须提供以下内容：诊断策略、检测到的遗传变异类型、其可报告范围、分析灵敏度和精密度。 ●建议38：NGS分析报告应在一页上总结患者的身份和转诊原因、测试的简要描述、结果摘要和主要发现。 ●建议39：每份报告中均应提及参考基因组构建和基因参考转录本版本（如适用）。 ●声明40：如果可用，应报告OMIM参考(https://www.omim.org/). ●建议41：在提供这类分析之前，实验室应根据国际建议制定报告基因组变异的地方政策并记录在案。 ●建议42：只有当与相应（疾病）基因相关的表型与患者的临床特征相匹配，并且可以进行后续研究以获得有关变体致病性的更多信息时，才应报告VUS。 ●建议43：应报告超出临床诊断确认或排除范围的探索性发现。 ●建议44：WGS报告应提交给转诊医生。报告中必须包括告知患者及其家人接受遗传咨询的建议。 总结与讨论 随着WGS的实施，诊断产品的范围已大大扩大，应对与给定表型相关的所有已知基因组改变进行全面诊断分析和解释。 此外，在这些建议中，WGS数据中线粒体DNA（mtDNA）变体或体细胞变体的解释有意未被提及，主要是因为当前WGS技术的技术限制。短读测序技术的一个限制是，它不能直接捕获表观遗传DNA修饰，从而无法捕获相关表观遗传表型的标记。这部分诊断谱在这些建议中没有具体说明。 未来，长读（单分子）测序和DNA修饰鉴定技术将是诊断工具箱中可预见的附加组件。这将需要开发额外的诊断（软件）工具，以提高诊断工作组的分辨率、实用性和价值。 |
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