宫颈癌筛查新方法--LOC平台上的pH-LAMP技术

在高收入国家，有效的宫颈癌筛查降低了其发病率和死亡率，但在全球范围内，2020年估计有600000例宫颈癌病例，342000例死亡。其中90%以上发生在中低收入国家（LMICS）。宫颈癌发病的唯一最重要的致病因素是HPV感染。病毒基因组整合到宿主染色体中，使得病毒癌基因HPV E6和E7能够通过干扰有丝分裂期间的着丝粒复制来促进基因组不稳定性。这导至了染色体重排和拷贝数变异。因此，通过Hybrid Capture-2或G5+/6+分析进行HPV DNA初步筛查，需要使用聚合酶链反应（PCR）和昂贵的热循环设备进行信号扩增或靶向扩增，被认为是宫颈癌检测的有效方法。

用Lugols碘或醋酸目视检查宫颈是一种潜在的低成本替代筛查策略，但对患者来说很不舒服，并且存在与目视检查相关的偏差。利用HPV以及肿瘤特异性标记物进行核酸扩增，进行一项可靠、易于实施的护理点检测，将是全世界宫颈癌检测的重要分诊工具。对于宫颈癌检测，选择最佳的HPV和肿瘤标记物至关重要。据报道，HPV-16和HPV-18导至高达70%的宫颈癌病例，分别约有60%和10%的病例出现；其他流行的HPV类型的发生率因地区而异。此外，癌细胞的增殖能力部分是通过端粒维持实现的，而端粒酶在HPV阳性癌症中普遍表达。hTERT（人类端粒酶逆转录酶）是一种端粒酶成分，在宫颈病变中显著过度表达，至少在90%的宫颈癌中可检测到，但在正常组织中呈低至零表达。因此，它是一种潜在有用的肿瘤特异性标记物。

环介导等温扩增（LAMP）方法已用于DNA和RNA的护理点检测，包括SARS-CoV-2和乳腺癌标记物。LAMP最初由Notomi等人开发，用于在单一温度下（通常在63到65度之间）快速扩增核酸无需PCR仪，从而使该技术成为护理点检测的理想技术。LAMP最初设计有四个引物，但Nagamine等人将其扩展到六个，会显著加速反应从1小时至10-15分钟。

近日，来自英国的研究团队在杂志Scientific reports上发表了一篇题为“Lab-on-chip assay of tumour markers and human papilloma virus for cervical cancer detection at the point-of-care”的文章，研究团队使用针对HPV DNA和hTERT mRNA的优化设计引物，将LAMP技术转化为LoC设备，并测试其检测宫颈癌的能力。LoC上的LAMP技术已被应用于乳腺癌生物标记物的检测和包括2019冠状病毒疾病在内的传染病诊断。LoC设备基于CMOS技术和离子敏感场效应晶体管（ISFET）传感器，与环介导等温扩增（LAMP）分析相结合，用于扩增HPV DNA和人类端粒酶逆转录酶（hTERT）mRNA。分子靶点的分析灵敏度达到每个反应一个拷贝的mRNA标志物，实现了hTERT的100的检测限。在组织样本中，4/5的恶性组织和2/5的良性组织中存在HPV-16 DNA，1/5的恶性组织和1/5的良性组织中存在HPV-18 DNA。在所有恶性组织和非良性组织中均检测到hTERT mRNA，已证实的试点数据表明，在资源有限的情况下，大规模使用LoC进行宫颈癌筛查的潜力。

图片来源：Scientific reports

对hTERT和GAPDH mRNA的LAMP分析采用10倍的连续稀释的合成RNA进行测试，每个反应范围为10 7到10 0拷贝。标准曲线如图1所示，具有良好的线性关系（R 2=0.99），检测限分别为100和1000份/反应，最大TTP(阳性时间)分别小于20和10分钟。

合成RNA中测试检测限和TTP。

图片来源：Scientific reports

使用LOC对45份来自当地组织采集的可用样本中的10份进行了HPV DNA和hTERT mRNA验证，其中DNA和RNA的数量和质量表明由于细胞数量多，提取效果良好。根据病理学分类，在这10个宫颈活检标本中，有5个良性，4个鳞状细胞癌（SCC）和1个腺癌（ADC）。

使用LC96设备，在样品H5、H7、H17和H27中检测到HPV-16 DNA，而在样品H11和H45中检测到HPV-18 DNA。LoC平台成功确认了检测结果，所有结果总结在表1中。两例（H2和H12）在使用pH-LAMP的LC96设备上HPV-16 DNA呈阴性，但在LoC平台上测量时呈阳性。使用PCR引物证实这些样本中存在HPV-16 DNA。为了解释这种差异，可能是这两种样本中的HPV-16 DNA拷贝数都处于检测极限，LoC上的较大样本检测体积能够检测到检测极限边缘的较低拷贝数。在5/5的癌症样本和0/5的良性样本中检测到hTERT mRNA的存在，完美地区分了肿瘤样本中的良性样本，使用LoC平台证实了结果。系统之间近乎完美的一致性表明了该平台用于进一步检测的潜力。LoC平台上所有测试的阳性时间（TTP）均少于25分钟，这证明了该系统在便携式平台上提供快速、准确结果的真正护理点潜力。

LC96系统和LoC平台上pH-LAMP或PCR测试结果汇总表。图片来源：Scientific reports

这项初步可行性研究表明，LoC设备能够使用LAMP从宫颈组织活检中准确检测宫颈癌的存在。HPV DNA和hTERT mRNA共同作为标志物使得灵敏度和特异性都很高，避免了单独检测HPV DNA的测试问题，如果不与其他筛查测试一起进行，可能会有很高的假阳性率。此外，HPV DNA筛查方法依赖于昂贵的设备，尤其是受宫颈癌影响最大的LMIC。其他筛查方法，如HPV“自检”试剂盒，基于对HPV菌株抗体的检测，并主要检测高危菌株，取决于宿主对HPV存在的免疫反应，可能呈假阴性，尤其是在感染的急性期。基于芯片的生物传感器电化学系统也被报道用于检测HPV DNA。

相比之下，本文描述的系统使用了一种LoC系统，它可以执行芯片实时DNA扩增，并且能够通过LAMP检测病毒DNA。这简化了DNA/RNA扩增的读出，并且可能适用于筛选应用所需的高通量。对HPV进行DNA验证，对hTERT进行类似的RNA验证。选择hTERT是因为以前的文献表明，由于hTERT在正常组织中不表达，因此它在宫颈癌中是一种很有前景的肿瘤标记物.

研究团队研究结果证实，该方法能够在标准台式PCR机上区分良性和肿瘤，在实体肿瘤组织的LOC设备上的结果相当。然而，在筛查环境中，使用的样本将是细胞而不是实体组织活检。尽管活检样本中可获得的肿瘤组织数量大于细胞拭子样本中的肿瘤组织数量，但后一种方法可产生50000个以上的细胞，足以提取可检测数量的mRNA。此外，细胞溶解和DNA/mRNA提取更容易从细胞学拭子中提取，因为不需要细胞材料的均质化，并且在使用刷状宫颈细胞学样本时应适用，已证实的试点数据表明，在资源有限的情况下，大规模使用LoC进行宫颈癌筛查的潜力。