国内外权威猴痘病毒Realtime PCR方法综述！

    关于猴痘病毒的基本知识，大家可以回看猴痘病毒，保持关注，不必惊慌！ 关于猴痘病毒我觉得除了从事实验动物、野生动物和海关检验检疫的人需要关注外，其他的中国百姓看看热闹就行了，不必过度恐慌。本文会分别介绍WHO（世界卫生组织）、WOAH（世界动物卫生组织）、CDC（美国疾控中心）和中国疾控中心关于猴痘的核酸检测方法。

一、猴痘病毒的全球流行情况

1.猴痘病毒全球人间流行情况

    根据世界卫生组织WHO的最新数据，从2021.513-6.10全球共有28个国家报告人感染猴痘病例，其中确诊病例1285例，亚洲至今无病例。

2.猴痘病毒全球动物间感染情况

    猴痘病毒本来就是一个人兽共患的病毒，在自然界中天然宿主包括松鼠、树松鼠、冈比亚袋鼠、睡鼠、非人类灵长类动物和其他物种。通过查找WOAH（世界动物卫生组织）最新信息：“迄今为止，没有家养动物（例如猫和狗）受到猴痘病毒感染的证据。也没有关于牲畜感染猴痘病毒的证据或报告。”

二、WHO关于猴痘病毒核酸检测的介绍

    WHO 在“Surveillance, case investigation and contact tracing for Monkeypox（Interim guidance）”中将realtime PCR和/或测序作为猴痘病毒的确诊方法。

    WHO在“ Laboratory testing for the monkeypox virus （Interim guidance）”中推荐优先使用猴痘病毒特异性realtime PCR或痘病毒通检方法对疑似样本进行检测。

    WHO在文中推荐了三篇文章用于实验室对猴痘病毒进行检测。

三、美国CDC关于猴痘病毒核酸检测的介绍

    美国CDC发布了“Non-variola Orthopoxvirus Generic Real-Time PCR Test”和“Monkeypox virus Generic Real-Time PCR Test”两个Real-Time PCR检测程序，关于猴痘病毒核酸检测的流程图如下：

1. 质量控制
   

1.1无模板对照（分子生物学等级水）和阳性对照用作检测质量指标，并且必须在每次检测期间运行。

1.2重复可用于确定精密度。如果使用重复，应具有小于3个 CT 值。如果范围超过此值，则检测无效，并重复测定。

1.3每次提取核酸时都应包括提取对照，即人类 DNA。如果提取对照未能用人类 DNA 引物和探针产生阳性结果，则测试是不确定的，必须重复。

1.4不确定的结果或偏差必须记录在实时 PCR 工作表上，并引起实验室主管的注意和审查。

1.5根据制造商包装说明书和/或操作手册在测试前进行设备维护和功能检查。

1.6有关其他质量控制措施，请参阅进行测定的实验室的实验室质量手册。

2.引物探针及反应条件

2.1Non-variola Orthopoxvirus Generic Real-Time PCR Test

2.2Monkeypox virus Generic Real-Time PCR Test

3.判定

3.1Non-variola Orthopoxvirus Generic Real-Time PCR Test

3.2Monkeypox virus Generic Real-Time PCR Test

检出即阳性

四、中国疾控中心关于猴痘病毒核酸检测的介绍

    2022年6月6日中国疾病预防控制中心发布了猴痘防控技术指南 （2022 版），附件3为“猴痘病毒实验室检测技术指南”

1. 实验室资质要求

    开展猴痘病毒核酸检测的实验室，应当符合《病原微生物实验室生物安全管理条例》（国务院令第424号）和《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》（卫办医政发〔2010〕194号）有关规定，具备国家卫生健康委备案的生物安全三级（BSL-3）实验室及以上实验室条件，并获得从事猴痘实验活动的批准，具备临床基因扩增检验实验室条件。

2.实验室生物安全要求

    根据《人间传染的病原微生物名录》中的有关规定，猴痘病毒生物危害分类为第一类，是一种高致病性病毒。涉及活病毒的样本灭活操作需在BSL-3及以上实验室的生物安全柜内进行。灭活样本中的病毒DNA提取可在生物安全二级(BSL-2)实验室或PCR检测的专门区域或房间进行，严格按照分区操作原则操作。

3.实验室分区要求

    原则上开展猴痘病毒核酸检测的实验室应当设置以下区域：试剂储存和准备区、标本制备区、扩增和产物分析区。三个区域在物理空间上应完全相互独立，不能有直接空气流通。各区功能分别是：

3.1.试剂储存和准备区：贮存试剂的制备、试剂的分装和扩增反应混合液的制备，以及离心管、吸头等消耗品的贮存和准备。

3.2.标本制备区：转运桶开启、标本灭活，核酸提取及加入至扩增反应管等。

3.3.扩增和产物分析区：核酸扩增和产物分析。

根据使用仪器的功能，区域可适当合并。如采用标本处理、核酸提取及扩增检测为一体的自动化分析仪，标本制备区、扩增和产物分析区可合并。

4.实验室猴痘病毒核酸检测

    实验室接到标本后，应当在BSL-3及以上实验室的生物安全柜内对标本进行清点核对，并对标本进行灭活处理。

    4.1样本：包括痘疱液、病变皮疹、痘痂、全血或血清、咽拭子、皮疹和痘疱表面或渗出液拭子和其它可疑标本。

    4.2提取试剂：组织基因组DNA提取试剂盒或血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒。

    4.3猴痘病毒检测引物、探针:

    4.4核酸检测：每次PCR反应，除了检测样本外，应加无DNA对照（用水代替DNA）、阳性对照；所有样本，包括对照，应设复孔。

    4.5核酸检测结果判断

（1）Real time PCR反应系统的质量控制:反应结果应同时符合以下2个条件，否则试验结果无效，应重新开展检测。阴性对照无扩增，为阴性。阳性对照未出现阴性结果。

（2）结果判定：

A.阴性：双孔Ct>37，或无Ct值；

B.灰区：一孔Ct值>37；

C.阳性：双孔Ct值<37。

所有阳性和处于灰区的样本应重复检测或经序列分析进行确诊。需注意：当样本仅为咽拭子或血清、血浆时，且检测结果为阴性时，应结合临床症状，慎重做出阴性诊断。

    对于一个中国还没有的病毒，国内公众号炒作了一波，IVD厂家纷纷推出产品股票涨了一波，商业炒作完毕后，科学问题终究是要回归科学，大家还是沉下心好好研究检测和质量控制吧！