PCR反应条件该如何优化？——常见问题及经验分享

2022-6-2 13:53| 编辑: 归去来兮| 查看: 2411| 评论: 0|来源: IVD学习笔记

摘要: 对于富含GC 的序列,可适当提高变性温度。但变性温度过高或时间过长都会导至酶活性的损失。

第一部分：基本概念和常见优化方法

1. 变性：在第一轮循环前,在94℃下变性5-10min 非常重要,它可使模板DNA 完全解链,然后加入Taq DNA聚合酶(hot start),这样可减少聚合酶在低温下仍有活性从而延伸非特异性配对的引物与模板复合物所造成的错误。变性不完全,往往使PCR 失败,因为未变性完全的DNA 双链会很快复性,减少DNA 产量。

一般变性温度与时间为94℃ 1min。在变性温度下,双链DNA 解链只需几秒钟即可完全,所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。对于富含GC 的序列,可适当提高变性温度。但变性温度过高或时间过长都会导至酶活性的损失。

2. 退火：这是PCR 的一个关键参数。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的Tm 低5℃, 当产物中包含有影响实验的非可异性扩增带时,以2℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。

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