技术心得分享丨长片段PCR

普通的PCR最长只能扩展2-3kb左右的短片段基因，对于5kb以上的长片段基因很难有效的扩增，这使PCR受到了很大限制。人们一直以来都在尝试利用PCR扩展出更长片段的PCR。

“LongPCR”这个名词和技术最早由美国华盛顿大学医学院的Barnes WM提出。其设想来自于他1992年一次实验错误，由此人们开始打开长片段PCR的大门，最终科学家发展出了一种新PCR技术，用于扩增大于5kb的DNA的片段。至今为止，长PCR技术已成功地用于扩增人类β球蛋白基因簇22kb的DNA的片段、噬菌体基因组42kb的片段和人类线粒体基因组16.3kb的片段。

1. DNA模板的质量问题

a. 模板提取不完整，其中不含你的目的基因，或目的基因含量太低。这个情况下应该使用较为新鲜的样本以及较为温和的提取方法来降低DNA模板因在提取过程中损伤情况。

b. 模板里面残留某种试剂成份，可能抑制Taq聚合酶的活性，如果是这种情况，可以用试剂盒把模板再纯化一下，或将模板做个梯度稀释以确定最佳的模板量。

2. DNA聚合酶的影响

a. Taq酶具有较高的错误率，导至产物3’端出现错配碱基，DNA合成提前结束。这时应该使用一些错配率更低的耐热聚合酶，如klentaq、pfu、rTth、Vent等。从不同文献中可以得到使用双酶系统更有利于长片段DNA的合成。

b. Taq酶在PCR的过程中活力下降，会增加非特异扩增以及二聚体的出现。这时应该使用缓冲能力较强的缓冲液，使缓冲液的pH值不会降得过低而影响酶活性；也可在PCR体系中添加一些促进剂，以降低退火温度或/和提高聚合酶的稳定性，从而促进长片段扩增的进行；也可稍微降低变性温度，以保证聚合酶的活性。

3. 模板损伤

在PCR过程中损伤了DNA模板，使其断裂或脱嘌呤，导至长片段PCR无法进行。这时我们可稍微降低变性温度或/和在PCR体系中添加一些促进剂，以降低退火温度，从而减少DNA模板的损伤。

4. 引物问题

a. 样品自身的基因型差异导至扩增失败。也就是说你的引物与某些基因型的样品结合的好，而和另一些基因型结合不好。可以设计一对更保守的引物试试。

b. 引物设计的不好，会导至二聚体出现、非特异性扩增或无法扩增。长片段PCR的引物设计原则和普通PCR一样，只是较长一些（21-34个核苷酸），以便提高退火温度，从而提高反应的特异性。但也不要太长，以免引物间互补形成二聚体。

5. 模板的结构复杂度

对于模板结构复杂，如GC含量高（>60%），有二级结构等，普通的长片段PCR可能难以延伸下去，加入DMSO等助熔剂可帮助扩增顺利进行，但DMSO有毒，而且用量需要优化。

6. 非特异性扩增或扩不出条带，这时可以通过调整PCR体系或调整PCR程序来减少非特异性。