《Nature microbiology》基于宏基因组学建立新的全球监测系统

近日，来自新加坡的一组研究团队在Nature microbiology杂志上发表了一篇题为“Metagenomics-enabled microbial surveillance”的文章，在这篇文章中，研究团队提出了一个战略性的设想，“建立一个新的全球监测系统，以各方充分透明为基础，使用最先进的数字工具连接世界各地的信息中心，包括动物和环境健康监测”。而基于宏基因组学的监测方法为这个宏大的设想提供了机会。文章为我们展示了公共卫生的传统病原体监测的领域、策略和方法，回顾了宏基因组学在样本制备、测序和生物信息学分析方面的技术障碍，以及宏基因组学监测广泛应用面临的挑战。研究团队最后还讨论了基于宏基因组学的监测的潜力，以加速和改变全球努力，在一个健康框架内检测人类健康风险。

图片来源：Nature microbiology

2019冠状病毒疾病的教训包括对动物传染病和潜在的传染病的潜在影响的认识。尽管紧急病毒目前备受关注，但我们不能忘记，由于细菌病原体的抗药性以及媒介传播、食物传播和水传播疾病，发病率和死亡率不断上升。人口增长、地球变化、国际旅行和医疗旅游都是导至传染病暴发频率增加的原因。为了做出知情的公共卫生决策，需要既易于使用，又能够同时准确识别多种微生物（病毒、细菌或真菌）的技术。基于宏基因组学的监测方法为改进已知和尚未出现病原体的检测提供了机会。

公共卫生病原体监测通常在医院、净水厂和农场进行，并专门应用于被认为可能是紧急疾病来源的地点。公共卫生病原体监测的总体目标是监测已知和尚未出现的病原体，并推动早期风险缓解计划，以保护人类和动物健康。

现有的公共卫生病原体监测方法包括基于综合征的感染事件监测、针对特定病原体的主动监测，例如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，以及基于实验室的监测。大多数以实验室为基础的监测工作侧重于监测临床相关特征，如培养菌株中的抗生素耐药性（AMR）和致病血清型。此外，医院中的特定房间或病房（例如，增强型护理单元）会使用基于培养的方法定期调查预定的病原体列表。因此，需要各种各样的实验室技术、设备、试剂和相关的专业技能，才能在医院对已知的人类病原体子集进行监测。

疫情的预防和管理。公共卫生和哨兵实验室通过参与疾病通报、已知人类病原体监测和患者样本病原体检测，支持传染病监测和疫情调查。除了通过培养和分子测试进行病原体鉴定外，监测还可以包括使用不同分析方法进行菌株分型，例如脑膜炎奈瑟菌血清分型、金黄色葡萄球菌MLST和抗生素耐药性测试。此外，血清分型等技术需要对活菌培养物进行操作，其中一些培养物具有实验室获得性感染（LAI）的巨大风险，例如脑膜炎奈瑟菌或伤寒沙门氏菌血清型。细菌、病毒和某种程度上的真菌的全基因组测序（WGS）正在得到广泛应用，但尚未成为大多数哨兵实验室的标准。

食品和水安全。传统的食品微生物安全监测依赖于对食品中病原体和卫生或安全指示微生物的有针对性检测。从复杂的食物基质中富集和选择特定物种需要多种培养方法。食源性AMR的监测基于对选定的食源性细菌病原体的敏感性测试。尽管对指示细菌（例如大肠杆菌）的监测被广泛采用，但水传播的病毒和原生动物病原体并没有得到一致的解决。自20世纪10年代初以来，WGS也被有效地部署在高收入国家，在疫情调查中追踪食源性病原体。值得注意的是，尽管食源性疾病的负担在低收入国家最高，但这些国家往往缺乏资源来采用WGS来缓解疫情。

人-动物-生态系统。牲畜与各种人畜共患病疫情有关，包括禽流感、猪流感和尼帕病毒引起的疫情。人畜共患病的监测要求人类健康、动物健康和农业部门有效地沟通疾病趋势，并参与对人类、动物（野生动物、牲畜和伴生动物）、环境（土壤和水）、媒介和食物来源的样本进行合作测试。全球流感监测和应对系统（GISRS）支持在世界各地的人类临床样本中检测流感并对其进行全基因组表征，这些数据由世界卫生组织（WHO）整合，以监测流感活动并指导疫苗组成。正在进行的2019年冠状病毒病（COVID-19）大流行进一步突显了人畜共患病和新发疾病所构成的公共卫生威胁，据报告，受反向人畜共患病感染的动物物种数量不断增加，证明跨物种传播的障碍较低。

社区卫生。废水（污水）处理系统的监测经常被认为是评估社区健康的一种有希望的方法，并已被埃及、印度、以色列、巴基斯坦、阿富汗和尼日利亚等国的脊髓灰质炎根除方案所采用。COVID-19流行病加速了改进样品处理和检测灵敏度的努力，以及进一步强调废水监测的有用性，以发现和中断爆发集群。然而，从废水中分离病毒需要专门的实验室设置和熟练的人员。对于严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）等高风险病原体，在常规临床诊断之外对样本进行操作需要生物安全3级控制，只有在资源充足、拥有高技能人员的中心才能使用。

医疗相关感染。除了监测临床相关的细菌和真菌分离物外，还定期对医疗环境，尤其是空气和水进行病原体和其他微生物污染采样。例如，在强化护理病房，定期培养军团菌属的饮用水，监测血液透析用水的活菌总数和内毒素水平。一些医疗指南主张，如果使用的水与强化护理中的患者直接接触，则应监测铜绿假单胞菌。医疗机构用水的常规监测在技术上要求很高，需要各种培养基和培养条件以及受过培训的人员。

AMR监控。全球抗菌素耐药性监测系统（GLASS）网络促进了AMR监测，并使世界各地的参与国能够收集、综合分析和共享标准化的人类细菌病原体AMR数据。目前的AMR监测依赖于相关病原体的成功培养和分离。然后，对培养分离物进行标准化的抗生素敏感性试验。存在于食物链、作物、动物和环境中的AMR可以通过水平基因转移被动员到人类和动物的细菌病原体中，从而影响人类和动物的健康。然而，这些非医疗领域的AMR监测还不太成熟和标准化。

综合病原体监测。鉴于样本类型和目标微生物种类的多样性，需要一系列处理和培养方法来实现最佳回收和分离。由于在培养过程中对已知的人类病原体进行了优先排序和选择，任何新的、新出现的或非典型的病原体及其相关的AMR决定因素可能都不会被检测到。总体费用、缺乏一致的工作流程和结果、许多分析的针对性（在这些分析中，你只能找到你想要的东西）以及缺乏较少偏见的成本效益选项，这些都是成功的重大障碍。相应地，病原体监测，尤其是医疗保健部门以外的病原体监测，资源仍然不足，而且多种检测的复杂性和要求可能会导至病原体的总体监测不理想。

公共卫生病原体监测的传统策略及流程。

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廉价、高通量测序技术的可用性为新一代病原体监测方法的开发铺平了道路。宏基因组学可以从含有多个物种的样本中查询遗传物质，可以实现检测已知和未知病毒、细菌和真菌的无培养方法和工作流程，还可以检测基因组背景之外的毒力和耐药性决定因素。随着易于分析和成本的降低，跨部门的大多数生物监测工作将受益于宏基因组方法的采用。尽管有这样的前景，但宏基因组工作流程中仍存在技术和分析上的复杂性，在纳入常规实验室监测之前，需要解决或考虑这些复杂性。

样本收集。这一步骤在宏基因组工作流程中具有最大的可变性，需要考虑各种样品基质及其物理和化学性质。这些包括拭子和胶带（例如皮肤、鼻腔和过滤器，例如水、污泥和半固体（例如粪便、污水、土壤或沉积物和食物）和液体（例如唾液）。一些样本，如污泥，可能需要大量收集以获得足够的生物量，相关的泄漏问题可能会对安全采样造成后勤挑战。其他考虑因素包括需要防止交叉污染，需要培养储备，以及是否需要在稳定培养基中进行冷链储存或运输，以尽量减少过度生长或核酸降解。

核酸提取。核酸提取方案的选择主要取决于使用剧烈物理破坏有效溶解细胞的能力与通过酶混合物（如MetaPolyzme）处理保持DNA完整性的重要性之间的权衡。由于PCR抑制剂的存在，以及需要将核酸从具有不同大小和浓度碎片的复杂基质中分离出来，某些样本类型（粪便、食物和土壤样本）天然具有更大的挑战性。

影响这一步骤的另一个方面是样本中微生物核酸的相对比例，这是影响分析成本、灵敏度和可行性的一个因素。微生物富集可以在提取核酸之前进行（例如，通过离心、过滤、培养富集或流式细胞术），也可以作为方案的一部分，例如，使用选择性裂解步骤去除真核细胞，或使用靶向探针富集和扩增微生物DNA。

文库准备和测序。目前的测序技术要么是以低成本提供短读的第二代系统（例如，Illumina，约100个碱基对），要么是具有较长读长度但在成本和准确性上权衡的第三代仪器（Pacific Biosciences and Oxford Nanopore Technologies）。其他可能影响监控平台选择的功能包括可移植性、获取和维护成本以及回答时间。使用便携式拇指驱动器大小的设备进行实时纳米孔测序的最新发展极大地扩展了基于现场测序的监测项目的可行性。

生物信息学分析。宏基因组数据的分析可以以不同的分辨率进行，从使用分类分类器识别和量化特定分类群到分析基因和途径，最后到全基因组重建、注释和系统发育分析。这是由一系列专业化工具推动的，如分类分类器、读取映射器、路径重建工具和基因组组装程序。在文章中，研究团队还介绍了一些更流行的管道和网络工具，它们将这些功能集成到非专家可以访问的用户友好工作流中。此外，还有用于病原体检测和识别的云部署临床宏基因组计算工作流，如SURPI和IDseq。

尽管在监测中实施宏基因组工作流程有着坚实的理论基础，但这项技术的广泛采用仍面临挑战。

敏感性、特异性和标准化。采用宏基因组学方法的一个重要考虑因素是分析的敏感性、特异性和再现性。与PCR等其他分子方法类似，宏基因组分析的敏感性和特异性取决于方案工作流程的优化，例如不同的目标病原体和不同的样品处理工作流程。分子生物学技术的发展以及机器人技术和实验室自动化的采用将极大地解决这一相关挑战，促进广泛应用。此外，广泛的样本基质和多步骤定制实验室和分析工作流程是变异性的来源，使宏基因组分析实施变得复杂。尽管存在这些挑战，但有研究表明，通过严格的优化、标准化和验证，可以实现实验室内的高再现性。端到端的标准化（包括生物信息学）和宏基因组工作流程的验证有助于宏基因组分析的应用。除了严格的方案标准化、常见样本类型的端到端指南、各种控制措施的纳入、质量保证和熟练样本的管道验证以及参考标准的使用之外，还需要进一步研究以宏基因组监测数据为基础开发公共健康风险模型。此外，监测的监管影响将是复杂的，由每个管辖区根据当地可用资源、当地监测需求、流行病学和当地政策来确定。

技术障碍。测序技术的快速发展，尤其是在产生高度准确的长读和超长读方面，以及进行实时、现场部署的全基因组分析的能力，使宏基因组学监测成为一种现实的选择。对于日常工作而言，具有长保质期的廉价且可靠的测序试剂盒是正在开发的重要领域。同时，能够对长读取进行敏感分类的生物信息学算法，如MetaMaps、快速准确的基因组组装，正在使强大的宏基因组监控工作流程触手可及。

具体而言，由于无法组装难以组装的内容，如质粒、16S rRNA和DNA重复序列，宏基因组组装的实用性和可靠性仍然受到限制。越来越多的研究利用了这一能力来扩大我们对微生物多样性的理解，并产生了新的MAG数据库，如UHGG、GTDB和IGGdb，这些数据库可能是未来微生物监测工作的有用资源。社区驱动的倡议，如基因组标准联盟，正在推动数据和元数据标准化工作，这对监测中使用MAG是有价值的。经过策划、质量控制的参考基因组数据库，如FDA-ARGOS，也将有助于提高宏基因组分析的准确性。

最近的几项进展将有助于加快监测工作。机器人技术和实验室自动化。宏基因组分析的简化工作流程使其易于实现各种形式的自动化，从而提高了可扩展性、安全性和再现性。特别是，开源自动化平台（例如Opentron和VoITRAX）通过共享可直接部署到参与实验室自动化系统的数字协议，实现了无缝实验标准化。

移动应用程序的基因组分析。数据合成和报告所需的时间可能是跨学科生物监测工作的一个主要瓶颈。因此，有必要将Oxford Nanopore公司的MinION等便携式测序技术与能够在该领域进行基因组分析的应用程序结合起来，例如MinKNOW应用程序和iGenomics应用程序。

自适应测序。Nanopore测序具有可以弹出DNA模板的功能，可以实时选择已测序的DNA。该方法最近的应用表明，它可以在不需要专门制备样品的情况下对元基因组中的目标区域进行富集测序，从而减少周转时间和资源需求。这项技术的进一步发展可能涉及选择特定突变，或者在观察到特定病原体特征后，自适应地选择毒力标记基因进行搜索。

公民科学。随着MinION sequencer和iGenomics应用程序等越来越容易使用的科学工具，公民科学家更广泛地参与环境监测现在变得可行。MetaSUB和American Gut等财团通过众包样本和资金，朝着这个方向迈出了第一步。除了帮助进行更广泛、更具代表性的抽样外，这些努力还帮助更广泛的社区参与他们的科学工作，从而促进更好地理解AMR等公众关注事项中的基础科学。

2019冠状病毒疾病表明，尽管这场大流行促使人们更加重视加强全球测序能力、共享基因组数据和协调监测工作的必要性，但直到最近，这些还不是高度优先领域。重要的是，我们面临的风险是，未来的工作可能仅限于监测类似SARS-CoV-2的病毒，或仅监测呼吸道病毒。通过扩大调查范围，宏基因组学希望统一微生物监测，转变公共卫生工作，以主动筛查威胁，让它寻求保护的公民参与进来，并在全球范围内与我们所生活的全球化世界协调一致。未来利用宏基因组学的微生物监测模型将有几个关键要素，包括：

（1） 一系列设施和个人可以应用的标准化流程和分析，包括资源充足的参考实验室和哨兵实验室，供感兴趣的公民科学家使用。包括预先设定的采样要求、改善分子生物学工作环境的重大投资和实现可编程自动化样品处理和测序的低成本液体处理自动化，以及以标准格式向全球存储库提交数据的来源跟踪验证管道。

（2） 在全球一体化健康网络中实现统一，从而跨领域（例如，临床、食品和水安全以及病媒控制）和跨国家的基因组数据可以通过适当的隐私、安全和数据所有权保障措施进行联合分析（例如，GISAID）。这将涉及集成流行病学的自动化分析（例如，TraceTogether应用程序)以及标识出关注事件（例如，AMR或病原体传播）。我们设想，需要通过世卫组织等多国机构在国家和全球一级整合和协调此类电子革命，以有效实现其目标。

（3） 高分辨率传输图谱，通过该图谱，全基因组（MAG或分离株）的可用性将有助于详细的源追踪、确定关注的领域和有针对性的缓解措施。

（4） 加强传染病研究，与世界范围内的精确医学革命类似，具有丰富元数据的大规模基因数据集的可用性将促进对毒力基因、微生物进化、质粒和噬菌体多样性的生物学和遗传学研究，进而反馈支持感染的合理治疗。

（5） 以数据为依据的公共政策和实践，将常规使用临床、流行病学和宏基因组数据的整合来确定预期公共卫生结果的政策选择。实施这种有证据支持的政策需要变得更加普遍，以提高我们避免未来大流行的机会。

（6） 在世界卫生组织2019冠状病毒疾病全球评估报告中，明确了国际监测和信息共享的重要性，在该报告中，专家小组建议进行关键的变革，“建立一个新的全球监测系统，以各方充分透明为基础，使用最先进的数字工具连接世界各地的信息中心，包括动物和环境健康监测”。这将超越目前各国更新治疗指南和抗菌药物管理方案的努力，并可能推动一个由类似于世界贸易组织的多边协议支持的国际合作的新时代。

基于宏基因组学的全球统一健康战略。

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