技术｜如何避免高通量NGS样品制备中遇到的瓶颈问题

传统的第二代测序（NGS）样品制备方法可能是劳动密集型的，需要有经验的实验室人员仔细处理样品，以产生高效和可靠的测序结果。最近几年，有几种样品制备的方法得到了发展和调整，目的是提高速度、产量和可重复性。

其中许多方法也或多或少地与自动化兼容，提供了将人为错误和变异最小化的机会，并进一步提高不同批次样品之间的一致性。

样品吞吐量是高通量测序实验室样品制备的一个关键因素，对生产力和成本效益有直接影响。

样品处理量是指同时（平行处理）或在特定时间范围内（每天、每周或更长时间）处理的样品数量。

NGS应用有不同的吞吐量要求。小规模/低通量的样品制备，如小型学术研究项目，通常可以通过人工处理来管理，而高通量的应用可能需要一定程度的自动化，取决于格式、规模和可用的设备选项。

各种规模的自动化加样设备可以实现NGS样品制备和NGS文库制备步骤的自动化，提供必要的速度、产量和可重复性，同时将人为错误的风险降到最低。在临床诊断等关键应用中，这种可靠性可以减少低质量数据的风险，以及对珍贵样本重复制备和测序的需要。

随着测序在临床应用中的加速采用，解决样本吞吐量这一工作流程中的潜在瓶颈的重要性正在增加，比如癌症诊断，早期和可靠的诊断能影响患者的长期预后。

基因组测序公司现在为基因测试提供公共和私人NGS服务。为了保持成本效益，这些公司需要保持高的样本吞吐量，每天处理大量的NGS样本，让他们的测序系统忙于搅动数据。

在NGS工作流程中的样品采集和测序之间，有两个关键阶段：样品制备和文库制备，每个阶段都包含一系列的步骤（图1）。

图1 | 从样品采集到测序和分析的典型NGS工作流程。样品制备方法可以有很大的不同，这取决于起始材料的来源、数量和质量。

NGS样品制备包括提取核酸的具体步骤，如从福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）人体组织样品中提取基因组DNA。例如，这些FFPE样本可能需要一个额外的步骤来修复受损的DNA，使其适合测序。

样品制备还可以包括一个扩增步骤，将核酸片段的数量增加到足以用于文库制备和测序仪器的水平。

文库制备从样品制备中获取纯化和扩增的核酸（DNA或RNA），并通过添加测序条形码和适配体将它们处理成最佳长度。在某些情况下，基于杂交或PCR的富集步骤通过富集感兴趣的特定区域进一步优化了测序库。

有各种技术和方法可用于NGS的样品制备。这些方法包括从传统的基于溶液的方案，通过固相和膜化学，到基于磁珠的方法。

基于磁珠的方法可以说是固相萃取的一个子类别，但有许多化学方法是可能的，而且工作流程很独特，完全可以作为一个单独的类型来考虑。

这些方法中的每一种都遵循DNA（或RNA）分离的三个基本步骤：

➤   裂解样品中的细胞，从温和的洗涤剂到积极的均质处理；

➤   清除污染物，包括不需要的核酸和变性的蛋白质；

➤   将核酸回收到适当的缓冲液中，用于任何下游的应用。

表1列出了这些技术和NGS样品预处理的几种方法。

表1 | NGS样品制备的技术和方法概述

最著名和最广泛使用的基于溶液的核酸分离方法可能是苯酚-氯仿DNA提取。虽然这种方法使用了危险的化学品，但如果处理得当，它能以较低的成本获得高质量的DNA。这种方法在研究实验室中很常见，学生和博士后研究人员进行苯酚-氯仿提取是日常工作的一部分。

然而，这种方法对高通量应用并不那么适用。它需要仔细处理，并可能有苯酚（一种抑制剂）的携带。此外，尽管现代自动化加样设备相当复杂，但它们无法判断并实现样品间产量和纯度的平衡，而这是研究人员特别关注的一点。

因此，基于苯酚-氯仿的样品制备更适合于低通量、高产量的需要，而不是测序实验室所要求的高纯度或高通量。

另一种更适合自动化的基于溶液的方法涉及基于Phi29 DNA聚合酶的DNA扩增。这种方法使用一个管子、一个温度的格式忠实地扩增有限的样本，比如来自单细胞的样本。

高保真度的Phi29 DNA聚合酶在30℃下仍有活性，不需要热循环，并能从几pg的起始材料中产生微克的DNA。Phi29依赖于等温扩增，可用于环状（或环化）DNA模板和线性DNA模板（图2）。

图2 | 基于Phi29 DNA聚合酶的扩增原理。模板DNA在多个位置用随机六聚体做引物。然后Phi29 DNA聚合酶扩展引物，复制模板并置换任何下游的扩展引物。链式置换和随后的引物导至新模板呈指数级增长，用于等温扩增。

使用Phi29聚合酶的商业试剂盒，如Genomiphi™和TempliPhi™ DNA扩增试剂盒，是为使用简单的自动化友好方案来减少动手时间而设计的。这些类型的试剂盒还可以提供单管或多孔板预分配试剂的选择，使它们适合一系列的吞吐量需求和液体处理系统。

固相法提取DNA依赖于带正电的二氧化硅和带负电的DNA之间可靠的化学作用。一个典型的方案是使用混沌盐来破坏链间的氢键，促进核酸磷酸残基吸附在硅膜上。

这种二氧化硅与DNA的结合是可预测的，而且很容易调节，使碎片和潜在的污染物被洗掉，纯化的DNA以高产量和高纯度洗出（图3）。

与基于溶液的同等方法，苯酚-氯仿萃取相比，二氧化硅旋流柱需要更少的移液步骤，而且所有的步骤都可以在同一个容器中进行。这些特点使得使用二氧化硅旋光柱进行NGS样品预处理可以通过机器人和液体处理系统实现高度自动化，因此既适合又能在高通量应用中普遍使用。

图3 | 使用硅胶膜旋流柱的固相核酸提取工作流程

磁珠是固相核酸分离（DNA提取和RNA提取）技术的一种形式，尽管也有一些表面化学成分能够捕获其他底物，如蛋白质。这些珠子是由铁氧化物颗粒组成的，如磁铁矿，这使它们具有超顺磁性。也就是说，它们只在有外部磁场的情况下才表现出磁性。

使用磁珠的协议是可扩展的，简单易行，通常只涉及三个关键步骤，可获得高纯度的核酸提取（图4），不需要离心或真空系统：

➤   颠覆性地将目标分子结合到磁珠上，并添加到任何类型的样品中；

➤   应用磁场来固定磁珠，同时洗去样品的剩余部分；

➤   调整缓冲条件以释放纯化的目标分子。

图4 | 基于磁珠的核酸分离概述。

（A）样品中的目标核酸根据缓冲条件与磁珠结合。

（B）磁场使磁珠固定，而不需要的碎片和污染物被洗掉。

（C）磁珠通过改变缓冲条件释放目标核酸。

磁珠的表面化学选择范围涵盖了所有的样品类型，提供了其他NGS样品制备方法难以达到的通用性水平。

例如，二氧化硅涂层磁珠非常适用于从血液、组织和细胞样品中捕获高分子量的基因组DNA，即使样品很少。对于mRNA，oligo（dT）涂层的珠子提供了直接从细胞样品中纯化的能力。

对于样品稀少的应用，如循环无细胞DNA（cfDNA）测序，坚固的二氧化硅涂层和高效的缓冲剂化学的组合可以提供分离低分子量目标分子所需的灵敏度。

在每一种情况下，结合和释放目标分子只需调整缓冲液条件，使工作流程很容易通过自动化加样设备技术实现自动化。

因此，基于磁珠的DNA和RNA分离提供了一种手段来避免一系列样品类型的样品制备瓶颈，同时在高通量环境中提供可靠的结果和可重复性。

这些磁珠可直接纳入样品制备工作流程，无需使用现有的苯酚-氯仿方法中的危险溶剂，并以成本效益的方式提供高结合能力和可扩展性。

基于磁珠的样品制备工作流程也比基于溶液的方法或旋转柱简单，不需要离心、真空系统，甚至不需要大量的经验或培训来实现高纯度DNA和RNA的分离。

磁珠还可以支持NGS文库预处理的大小选择和清理，支持低到高通量、一致性，以及在整个NGS工作流程中节省时间和成本。

有许多用于NGS样品预处理的商业产品。大多数涉及一定程度的离心，尽管有些依赖于真空管路。一些供应商提供这些产品作为自动化“封闭”系统的一部分，这对用户来说既有优点也有缺点。

与所谓的“开放”系统相比，用户可以从多个制造商那里选择组件，为自己的目的开发一个具有成本效益的方案，而封闭式系统将用户限制在同一制造商或其合作伙伴的产品上。制造商采取这种方法是为了确保组件之间完全兼容，并提供一定程度的保证，即产量和质量将是一致的。

大型集成系统可与其他设备联用，以执行其他NGS样品制备步骤，如扩增。尽管这些集成系统很适合高通量应用，但它们需要相对大的投资。

这种投资水平可能只在某些情况下是合理的，例如运行临床NGS样本的高通量测序实验室。对于这些类型的实验室来说，拥有一个单一的供应商意味着整个工作流程已经被尝试和测试过了，而且一个单一的支持联络点可以将任何故障排除期间的延误风险降到最低。