德国弗莱堡大学—微系统工程系—传感器实验室的Can Dincer研究团队在Advanced Materials（近五年期刊影响因子：30.254）杂志上发表其团队的研究成果“CRISPR/Cas13a-Powered Electrochemical Microfluidic Biosensor for Nucleic Acid Amplification-Free miRNA Diagnostics”，详细报道了一种基于CRISPR/Cas13a的微流控电化学传感检测平台，用于microRNA的检测。 √ microRNA简介 microRNA (miRNA) 是一类内生的、长度约为20-24个核苷酸的小RNA，其在细胞内具有多种重要的调节作用。每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNA也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNA的组合来精细调控某个基因的表达。据推测，miRNA调节着人类三分之一的基因。最近的研究表明大约70%的哺乳动物miRNA是位于TUs区( transcriptionunits，TUs )，且其中大部分是位于内含子区。一些内含子miRNA的位置在不同的物种中是高度保守的。miRNA不仅在基因位置上保守, 序列上也呈现出高度的同源性。miRNA高度的保守性与其功能的重要性有着密切的关系。miRNA与其靶基因的进化有着密切的联系, 研究其进化历史有助于进一步了解其作用机制和功能。 microRNA（miRNA）已成为临床诊断中多种疾病的生物标志物。这些miRNA的失调可能与多种不同的疾病有关，如癌症、痴呆症、心血管疾病等。有效治疗这些疾病的关键在于早期进行准确的初步诊断，从而提高患者的生存机会。 目前检测miRNA的传统方法包括：微阵列法、RNA测序法和定量聚合酶链反应（qPCR）。上述这些传统方法尽管强大，但都有其局限性：笨重且昂贵的设备、复杂的样品制备流程、漫长的周转时间，使得大多数方法局限于设备精良的实验室，从而限制miRNA筛查的广泛应用。因此，迫切需要开发出易于使用、便携且无需扩增的方法，用于即时检测miRNA。这将使得快速、多功能和低成本的miRNA定量检测，不仅局限于设备精良的实验室，也可以普及到资源有限的地区。 为了解决上述问题，Can Dincer研究团队开发了基于CRISPR/Cas13a的微流控电化学传感检测平台，将CRISPR、微流控和电化学传感三者有机结合，不仅实现了高灵敏度和高选择性的诊断测试，而且实现了诊断设备的小型化、便携化。此外，CRISPR核酸酶—Cas13a的使用，使得整个技术平台可以针对几乎任何RNA，为miRNA诊断创造了一种新颖而强大的工具。
CRISPR技术与用于miRNA诊断的电化学微流控生物传感器的结合 √ CRISPR 基于CRISPR/Cas13a的微流控电化学传感检测平台的特异性，取决于靶向特异性crRNA（CRISPR RNA），该RNA将CRISPR核酸酶—Cas13a引导至目标RNA序列，当crRNA与目标RNA序列结合后，CRISPR核酸酶—Cas13a的切割能力被激活，随后开启疯狂切割模式，变身为高度灵敏的“RNA探测器”。 注：CRISPR/Cas13a就是大名鼎鼎的SHERLOCK（神探夏洛克）。
√ 微流控 & 电化学传感器 如下图所示，微流控通道由两个不同的部分组成：一个是固定区（Immobilization area），另一个是电化学反应池（Electrochemical cell），此外，两者之间还有一个疏水的阻挡屏障（Stopping barrier）。
1、固定区（Immobilization area） 生物传感器固定区域的表面通过抗生物素抗体（Anti-biotin Ab）进行预功能化，然后使用牛血清白蛋白（BSA）封闭传感器表面。生物素（Biotin）和荧光素（Fluorescein）标记的reRNA（Reporter-RNA）通过抗生物素抗体（Anti-biotin Ab）间接固定在生物传感器固定区的表面；葡萄糖氧化酶（GOx）标记的抗荧光素抗体（Anti-fluorescein Ab）与荧光素（Fluorescein）结合，进而与reRNA（Reporter-RNA）一同固定在生物传感器固定区的表面。
2、电化学反应池（Electrochemical cell） 电化学传感采用三电极体系，包括铂工作电极、铂对电极和银/氯化银参比电极。葡萄糖氧化酶（GOx）催化葡萄糖（Glucose）氧化反应中释放过氧化氢（H2O2），使用三电极装置检测产生的过氧化氢（H2O2）。
√ CRISPR微流控电化学传感检测过程 检测样本中的miRNA，只需将含有靶miRNA的样本和crRNA/Cas13a复合物溶液充分混合后，一并注入到微流道中，并放置在37°C中孵育。 如果样本中存在靶miRNA，那么在生物传感器固定区，CRISPR核酸酶—Cas13a会切割传感器固定区表面的reRNA（Reporter-RNA），从而使葡萄糖氧化酶（GOx）脱离传感器固定区。对微流道清洗后，去除所有被切割下来的葡萄糖氧化酶（GOx）。再向微流道中注入一定浓度的葡萄糖（Glucose）溶液，过氧化氢（H2O2）产生的电流密度与传感器固定区残留（未被切割）的葡萄糖氧化酶（GOx）的量成正比，与样本溶液中目标miRNA的浓度成反比。
在有无靶miRNA的样品中，CRISPR电化学微流控传感器切割流程示意图
观看下方视频，更好地了解CRISPR微流控电化学传感检测平台的工作原理。
通过这种独特的组合（CRISPR and 微流控 and 电化学传感器），无需任何核酸扩增即可实现miRNA的定量检测，例如，对潜在肿瘤标志物miRNA：miR-19b和miR-20a的定量检测。 Can Dincer研究团队对脑癌患儿血清样本中的miR-19b进行检测，通过实验数据证实了此平台的可行性，并通过定量RT-PCR法对所得的结果进行验证，表明CRISPR电化学微流控生物传感平台是一种低成本、易于扩展、无需靶点扩增的核酸诊断工具。 相比于传统检测方法，CRISPR电化学微流控生物传感可以在短时间内以高灵敏度和高选择性定量miRNA，为新一代现场miRNA诊断开辟了道路。 |
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