技术｜一文读懂聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）

凝胶电泳是生物学科实验室中的一项基本技术，可以分离大分子，如DNA、RNA和蛋白质。不同的分离介质和机制允许这些分子的子集通过利用其物理特性而被更有效地分离。特别是对于蛋白质，聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）通常是首选技术。

在这篇文章中，我们将考虑PAGE是如何工作的，如何解释它的结果以及一些应用。

PAGE是一种技术，根据蛋白质等大分子的电泳迁移率（即分析物向相反电荷的电极移动的能力）来分离它们。在PAGE中，这由分子的电荷、大小（分子量）和形状决定，分析物通过聚丙烯酰胺凝胶中形成的孔隙移动。

与DNA和RNA不同的是，蛋白质的电荷根据所加入的氨基酸而不同，这可能影响它们的运行方式。氨基酸串也可能形成二级结构，影响它们的表面大小，从而影响它们如何通过孔隙移动。因此，如果需要更准确地估计蛋白质的大小，有时最好在电泳前将其变性，使其线性化。

聚丙烯酰胺形成的孔比用于琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖的孔小。这使得它更适合于在大型多核苷酸DNA或RNA片段上分离蛋白质，并允许分离相对较小的蛋白质。因此，当人们提到「蛋白质电泳」时，他们最经常提到的分离技术是PAGE。

根据分析的目的，PAGE可以在变性或非变性的条件下运行。

阴离子洗涤剂十二烷基硫酸钠（SDS）与热量以及有时与还原剂结合使用，在电泳分离前使蛋白质变性，这一过程被称为SDS PAGE。

热力破坏了保持二级和三级结构的氢键，而还原剂，如β-巯基乙醇，则裂解二硫桥。蛋白质被线性化并与SDS复合，因此所有的蛋白质都具有相似的质量电荷比。这就消除了结构和电荷的影响，蛋白质仅根据其分子量的不同而被分离（图1）。这个系统是由Ulrich K. Laemmli开发的[1]，通常用于分离5~250 kDa的蛋白质。

图1 | 用于SDS PAGE的蛋白质的线性化。二硫键被β-巯基乙醇还原，而SDS则否定了质量-电荷比的差异，这样蛋白质就可以根据分子量进行分离。

在本地PAGE[2]中，这些键被保留下来，保留了蛋白质的高阶结构。因此，蛋白质在凝胶中的分布主要受蛋白质的电荷（由其氨基酸序列和翻译后修饰决定）和分离的pH值的影响，而不是它的kDa大小。

然而，它允许研究人员分析自然或「原生」状态的蛋白质。这在分析结合蛋白或复合物时可能是可取的，例如，当它们的生物活性保持不变是很重要的。由于这里的目的是保持蛋白质的自然状态，所以在样品制备中不使用SDS、还原剂和热量，也可以使用较低的电压进行分离。

PAGE的基本原理是通过电流使分析物通过聚丙烯酰胺凝胶的孔隙来分离它们。为了实现这一目的，通过添加过硫酸铵（APS）使丙烯酰胺-双丙烯酰胺混合物聚合（聚丙烯酰胺）。在四甲基乙二胺（TEMED）的催化下，该反应形成了一个类似于网状的结构，其中有孔隙，分析物可以通过它移动（图2）。

图2 | 丙烯酰胺的聚合和交联。TEMED催化的APS导至了丙烯酰胺的聚合和交联。丙烯酰胺成分的总浓度和丙烯酰胺与双丙烯酰胺的比例会影响凝胶的孔径大小，从而影响可解析的蛋白质尺寸范围。

凝胶中包含的丙烯酰胺总量的百分比越高，孔径就越小，因此能够通过的蛋白质就越小。丙烯酰胺和双丙烯酰胺的比例也会影响孔径大小，但这通常保持不变。较小的孔径也会降低小蛋白质在凝胶中移动的速度，提高它们的分辨率，防止它们在电流作用下迅速跑到缓冲液中。

3.1          设备

无论运行哪种类型的PAGE凝胶，设备的设置都是一样的。但是，如果你在运行SDS PAGE和Native PAGE之间转换，请确保所有的设备都彻底清洁，或者尽可能为每种类型的设备准备一套单独的设备，以避免变性剂交叉污染到原生分析中。制作凝胶需要玻璃板、垫片、梳子（用于创建样品孔）和浇铸框架。垫片和梳子的大小将取决于您希望运行的样品量和数量。重要的是，在组装之前，玻璃板要彻底清洁和干燥，以防止凝胶质量差或浇注凝胶时出现泄漏。如果没有去除基于蛋白质的残留物，可能会在凝胶被染色时损坏。

为了运行凝胶，还需要一个电泳槽、电源组和电泳架（携带电流通过凝胶）。

3.2          缓冲液

PAGE需要三类缓冲液：

➤   凝胶注膜缓冲液（用于制造凝胶）；

➤   样品缓冲液；

➤   运行缓冲液（用于填充进行电泳的凝胶槽）。

电泳可以利用连续或不连续的缓冲液系统[3]。连续缓冲液系统只有一种缓冲液用于样品、凝胶和凝胶槽，很少用于蛋白质分析，因为分离往往是弥散的，分辨率很低。不连续的缓冲系统，最常被用于蛋白质分离，在凝胶和运行缓冲液中使用不同的缓冲液。

所用的凝胶还包括两层（堆积凝胶和解析凝胶），具有不同的孔径和不同的缓冲液组成。不连续的缓冲液系统往往能产生更高的分辨率分离。

基于Tris的缓冲液被用于PAGE。三甘醇、双三甘醇、三醋酸酯和三三甘醇，都添加了SDS，用于SDS PAGE，其中三甘醇是最常用的。对于Native PAGE，最常使用的是不含SDS的三硼酸-乙二胺四乙酸（TBE）。除了不同的凝胶比例外，pH值和离子强度的不同也是造成缓冲不连续的原因。

3.3          凝胶

蛋白质凝胶的形成分为两部分，即堆积凝胶和解析凝胶。堆积凝胶的作用是允许样品加载，并引导样品进入解析凝胶的顶部，因此它们都同时进入。然后，样品中的蛋白质将被分离，以便它们能在解析凝胶中被「解析」。

最佳的凝胶百分比将取决于要分离的蛋白质的大小。百分比越低，能够通过的蛋白质就越大。不管分析物的大小，较低百分比的凝胶（通常约为4%的总丙烯酰胺）被用于堆积凝胶，因为它不进行分离。它的pH值通常比解析凝胶低（约为6.8，而不是8.8），并且具有不同的离子含量，以帮助将样品分析物集中到一个紧密的带子中，从而进入解析凝胶。

分解凝胶的百分比根据你希望分离的蛋白质的大小而变化，通常在7~12%之间。也可以创建梯度凝胶，在样品进入的顶部有低比例的聚丙烯酰胺，沿着样品的路径增加，这样可以分离更多的蛋白质大小。对于SDS PAGE，用于凝胶的缓冲液包括SDS，但对于Native PAGE，则省略了这一点。

首先将溶解的凝胶倒入到刚好低于梳子的水平。

在加入聚合剂后，你需要在凝胶开始凝固前快速工作。应将凝胶移到玻璃板之间，避免引入气泡，然后在上面倒上一层水合异丙醇（IPA）以使边缘清晰。一旦分解凝胶凝固，倒掉IPA并用水反复冲洗。

现在应将叠层凝胶移到上面，并将梳子放好，确保没有气泡。凝胶一旦凝固，可以立即使用，或储存在冰箱的密封袋中，加一点水以避免脱水，直到需要。它们可以成功地储存几天，甚至长达几周，但储存的时间越长，两个凝胶层之间的扩散就越多，由此产生的分离可能受到影响。

可以购买预制凝胶；但是，它们通常比自己制作要贵。

3.4          样品准备

根据你是进行SDS PAGE还是Native PAGE实验，样品的准备会有所不同。

对于SDS PAGE，样品，如裂解的细胞、组织或细菌，要与含有一些重要成分的负载染料混合。染料，如溴酚蓝，可以在装载和运行期间看到样品。甘油有助于减轻样品的重量，防止其在装载过程中漂出孔外。SDS和β-巯基乙醇使存在的蛋白质线性化，并否定电荷的差异。混合物被加热，100 °C 3分钟通常就足够了，这也有助于使蛋白质变性。

对于Native PAGE，SDS和β-巯基乙醇不包括在装载染料中，也不进行加热步骤以保持蛋白质的原生构象。

在加载凝胶之前，样品要进行离心处理（16100 × g，2分钟即可），以去除不溶性碎片。只有上清液应被加载，因为颗粒会干扰样品在凝胶上的运行。

3.5          质量控制

通常在样品行的两端加入大小标记，以便对检测到的任何条带进行大小估计。参考蛋白以及阳性和阴性对照应尽可能包括在内，以验证未知样品的观察结果。已知能产生感兴趣的蛋白或纯化的目标蛋白的菌株或细胞的裂解液可以提供一个合适的阳性对照。

而与未知样品相同的菌株或细胞系，但其中编码目标蛋白的基因已被去除，可提供合适的阴性对照。尽可能模仿未知样品的对照在检查非纯化蛋白的样品时特别有用，因为它有助于区分背景带和感兴趣的带。

3.6          电泳

在电泳槽中加入适当的运行缓冲液，通常三甘醇-SDS用于SDS PAGE，TBE用于原始PAGE。

将凝胶（仍在玻璃板之间）从浇注框中取出，并将其插入电泳框中。将其小心翼翼地放入电泳槽中，并加入运行缓冲液，使孔的顶部被淹没。将梳子留在原处，直到你准备运行凝胶，因为这有助于保持孔的完整性。

移除梳子后，应使用非常细的移液器吸头或针头装载样品。小心不要损坏孔的边缘或过量，否则样品可能会在通道之间交叉污染。与样品结合在一起的装载染料有助于直观地指导这一过程，同时也将样品混合物拉到孔的底部。

将盖子放在罐子上，确保电极的方向正确（黑对黑，红对红），并向装置施加电流。所用的电压和运行时间将取决于所使用的分解凝胶的百分比、分析物的大小以及是否正在进行SDS分析或原生分析。

通常情况下，200 V 35分钟是SDS PAGE的良好起点，100 V 40分钟是Native PAGE（图3）。预先冷却本地PAGE的运行缓冲液可以帮助防止样品升温，限制变性和损伤。

图3 | 在PAGE中进行蛋白质电泳的样品准备。

1）准备分析的样品。

2）铸造凝胶并准备好设备。

3）将缓冲液加入到凝胶槽中，并将样品/对照品加入到凝胶中。

4）对样品施加电流以分离蛋白质。

5）对凝胶进行染色和可视化。

3.7          染色和可视化

一旦样品在凝胶上迁移了足够的距离，可以通过染料的前沿位置看到，凝胶框架就会从罐子里取出来，凝胶会被小心地从玻璃板上移走。堆积凝胶已经完成了它的工作，可以小心地切下并丢弃，只留下解析凝胶。

现在必须对蛋白质进行染色，通常使用库马西亮蓝[4, 5]，这是一种有机染料，能与碱性氨基酸复合，对蛋白质进行染色并将其固定在原位。凝胶被浸没在通常由20%（v/v）甲醇、10%（v/v）冰醋酸和0.1%（w/v）库马西亮蓝组成的染色液中，用水调和。

将凝胶浸没在染色剂中约1小时（或直到充分染色），并轻轻搅拌（注意不要撕裂凝胶）。加热可以加速这一过程，但不要将溶液煮沸。然后，洗掉多余的染色剂；你会注意到染料也会染上聚丙烯酰胺凝胶，尽管程度比蛋白质要小。

因此，必须对凝胶进行解染。由于染料与蛋白质的结合比凝胶更紧密，可以用类似于染色剂的溶剂将染料从凝胶的无蛋白质部分去除，而染料则被省略。典型的去污剂使用50%（v/v）的甲醇在水中加10%（v/v）醋酸。

凝胶可以在去污剂中放置一夜，并轻轻搅拌，以获得清晰的背景和被染色的蛋白质条带，但是和染色一样，去污剂可以通过加热来加速。然后将凝胶在水中冲洗，可以立即进行观察；可以将其保存在少量水中以防止脱水。

有无需去渍的蛋白质染色溶液，如果需要快速的结果，这些溶液可能特别有用。然而，它们通常比标准染色方案更昂贵。其他染色剂，如银染色[6]，也可用于特定目的，但库马西染色是最常见的。

由于PAGE凝胶通常用Coomassie亮蓝染色进行检测，因此可以用肉眼进行观察和审视，这与琼脂糖DNA凝胶不同。可以用相机捕捉图像，以提供长期记录。标记物梯子通常与蛋白质样品一起运行，以使它们的大小（通常以kDa为单位）得到估计（图4）。

重要的是要记下哪个样品被装入哪个泳道，以便准确解释结果。在Native PAGE凝胶中，由于二级结构会影响其通过凝胶，因此尺寸可能不准确。在这种情况下，可以将参考蛋白包括在内，让用户了解他们的目标物可能出现的方式和位置。

当同一凝胶上的样品被比较时，如不同的处理、条件或结合伙伴，寻找差异时，Native PAGE也非常有用。带子的强度可以表明蛋白质的数量，蛋白质越多，带子越强。如果加载了太多的样品，条带可能会出现强烈的暗色涂片，很难或无法解释。在这些情况下，你应该考虑用更少的样品重复分析。

SDS PAGE与Taq DNA聚合酶。SDS PAGE是一种有用的技术，可以根据蛋白质的电泳流动性将其分开。标记物（左侧泳道）是Precision Plus蛋白质标准品全蓝。进行这种SDS PAGE是为了确定Taq DNA聚合酶的分子量。

图4 | 使用Taq DNA聚合酶的SDS PAGE。SDS PAGE是一种有用的技术，可以根据蛋白质的电泳流动性将其分开。标记物（左侧泳道）是Precision Plus蛋白质标准品的全蓝色。进行这种SDS PAGE是为了确定Taq DNA聚合酶的分子量。

有时，蛋白质在单一维度的分离不足以解决类似的物种。在这样的情况下，二维的分离可以增加所需的分辨力，因为两个分子在两个不同的性质上非常相似的可能性较小。二维聚丙烯酰胺凝胶电泳，或称2D PAGE，于1975年由Joachim Klose [7] 和Patrick H. O'Farrel [8] 同时提出。

在第一维中，蛋白质根据其等电点（与电荷和pH值有关）被线性分离。在第二维中，根据分子质量将分子与第一次分离成90°进行分离，产生电泳图（图5）。

图5 | 2D PAGE的例子。水平蛋白质分离（X轴）是根据等电点，垂直分离（Y轴）是根据分子量。该样本来自有致病真菌的黄瓜植物。

PAGE被用于许多生物学科，从分子生物学和法医学到生物化学和基因组学，提供了一个重要的分析和诊断工具。让我们考虑一些技术，其中PAGE是一个重要的组成部分。

6.1          蛋白质分析

直接用PAGE检查样品可以提供一些有用的指标，包括：

➤  是否有预期的蛋白质存在；

➤  它的大小（或表面大小）是多少；

➤  大约有多少；

➤  蛋白质样品的纯度是多少；

➤  如果裂解（例如从一个标签）已经成功了；

➤  蛋白质存在于哪个部分（例如，来自细胞裂解液部分）；

➤  蛋白质的溶解度。

当生产重组蛋白时[9]，重要的是能够检查感兴趣的蛋白在纯化过程中是否在多个阶段丢失，以及它是否以预期的大小出现。根据它所处的馏分，它还可以表明是否存在蛋白质溶解度的问题，这可能会影响它的功能或结合能力，或排除它在所用条件下的纯化。

纯化过程结束时的多余条带也可以表明存在污染物。重组蛋白是疫苗和生物制药开发的关键，也是诊断测定和研究的关键。

蛋白质分析对许多学科也很重要，包括食品和饮料开发[10]、质量控制[11]、安全[12, 13]和欺诈检测[14]以及环境样品的分析[15, 16]。然而，随着技术的进步，变得更加实惠和方便，这些领域的一些分析正在被质谱（MS）等技术取代[17]。

6.2          电泳迁移率测定

电泳迁移率测定（EMSA）是鉴定核酸-蛋白质复合物的一个重要实验工具。这可以帮助确定结合位点，如转录因子使用的位点[18]。虽然琼脂糖凝胶经常被用来实现这一目的，因为它们允许较大的DNA-蛋白质复合物更容易迁移，但PAGE可以提供更大的分离分辨率，并为一些复合物提供更大的稳定性[19]。

6.3          Western blot

样品蛋白质的分离是任何西方印迹实验必不可少的第一步，而PAGE是实现这一目的的典型技术。虽然PAGE凝胶被印在膜上用于印迹本身，但重复的PAGE凝胶也可以用Coomassie亮蓝染色，以作为解释Western印迹结果时的加载对照。

这些可以用来诊断传染病和非传染病，评估治疗干预的效果，为基础研究提供信息，检查重组蛋白的纯化[20]，并为全能研究提供功能或验证信息。

6.4          提取用于质谱分析

一旦分离，凝胶带中的蛋白质可以被切除和纯化，以便进一步分析。诸如质谱等技术可用于获取样品中蛋白质的深度信息。

6.5          尿液蛋白电泳和免疫固定电泳

PAGE可以提供一个有用的诊断工具，检测尿液或血液等体液中某些蛋白质的数量。琼脂糖凝胶电泳和毛细管电泳也可作为这些分析的替代品。

通常情况下，尿液中不应该有或只有很少的蛋白质，所以尿蛋白电泳（UPEP）试验，通常测量白蛋白和球蛋白，可以作为病理变化的指标。尿液中高水平的蛋白质可以作为许多疾病的指标，包括炎症、肾脏疾病[21, 22]、感染和某些类型的癌症（如骨髓瘤）[23]，并有助于指导进一步的调查或治疗。

白蛋白和免疫球蛋白[24]也可以在血清样本中进行分析（血清蛋白电泳（SPEP）），以诊断一系列疾病，包括癌症，如多发性骨髓瘤[25]、淋巴瘤和白血病、肾病、肝病、营养不良，以及一些神经系统和自身免疫疾病。

免疫固定法[26]可用于这些测试，以确定某种蛋白质的某些亚型，如免疫球蛋白A（IgA）λ[27]或M蛋白的重链和轻链类型[28, 29]。