Cell-free DNA 液体活检中应用最广泛的分析指标是外周血游离DNA（cfDNA）。此外，还包括其他体液系统中肿瘤释放的cfNA（cfDNA、cfRNA等）。 cfDNA 就是游离于细胞外的 DNA，它即包含 ctDNA （circulating tumor DNA）也包括来自于正常细胞的 DNA 碎片。例如，脑脊液、唾液、尿液、胸腔和腹腔积液、粪便等，都是cfDNA的潜在来源，上述样本经cfDNA富集可用于不同类型癌症的检测。在健康个体中，cfDNA来源于正常的细胞更新，而在癌症患者中cfDNA含量会升高，cfDNA长度约为167bp，半衰期不足1小时。 DNA甲基化 表观遗传学信息如甲基化或蛋白质生物标记物结合ctDNA已被证明有助于早期确定肿瘤的起源。研究人员发现，来自甲基化组数据的肿瘤和组织特异性模式有助于疾病分类。肿瘤DNA甲基化谱与血浆ctDNA甲基化谱高度相关，可用于乳腺癌、结肠癌、肝癌和肺癌等疾病的诊断和预后判断。然而，与DNA变异检测类似，cfDNA中DNA甲基化变化程度变化和低起始量，对检出技术的覆盖率、成本和灵敏度提出了巨大挑战。 Cell-free DNA甲基化的临床应用 ▶ 癌症筛查与早诊 在无症状人群中，液体活检可以用于癌症患者的识别，以提高早期诊断和更好的干预。研究表明，肿瘤DNA（ctDNA）可用于早期肺癌诊断(I期或II期)，具有较高的敏感性和特异性。除了DNA突变，DNA甲基化和cfDNA水平的量化可以结合起来提供稳健和一致的结果。SEPT9基因甲基化检测是通过美国食品与药物管理局（FDA）批准的第一个结肠直肠癌(CRC)血液筛查试验，与蛋白质标记物相比，具有较高的敏感性和特异性。 ▶ 微小病灶残留和复发风险评估 微小病灶残留(MRD)是手术或治疗后肿瘤复发的主要原因。不幸的是，目前还没有有效的方法来鉴别MRD和复发。此外，用于复发风险分层的常规临床或病理参数不足以准确指导辅助治疗，导至患者在大部分患者已治愈且不需要此类潜在有害治疗的情况下，仍不得不接受不加区分的治疗。经证实，ctDNA甲基化标记物可以提示MRD的存在，即使在没有任何其他临床疾病证据的情况下，也可以识别复发风险高的患者。将患者分为高风险组和低风险组将使可能受益最大的患者能够接受辅助治疗，同时使低风险患者免于不必要的合并症和不良事件的风险。 最近，一项前瞻性临床试验评估了II和III期CRC患者术后ctDNA 标志物(WIF1和NPY)与肿瘤复发的关系。采集805例II-III期CRC患者术前和术后的血浆样本(NCT00958737)。在手术切除后第一次随访时，采用ddPCR检测WIF1和NPY在ctDNA甲基化情况。作者观察到，ctDNA阴性组2年无病生存率显著高于ctDNA阳性组(82% vs 64%)，这表明ctDNA甲基化分析可以用于预测微小病灶残留的病变。 ▶ 治疗选择和预后 cfDNA的半衰期较短，可以与肿瘤细胞状态直接相关，从而为治疗期间持续动态观察监测癌症负担提供了可能性。有研究表明ctDNA动力学与治疗反应相关。例如，血清的MGMT的甲基化水平与原发组织高度，在cfDNA中检测MGMT的甲基化水平能够预测胶质细胞瘤患者在细胞毒性治疗后的响应时间和进展。一项前瞻性研究验证了乳腺癌甲基化特异性PCR cfDNA检测方法，该方法针对6个癌症相关启动子的CGI来监测治疗反应。这6个位点的累积甲基化得分与转移性乳腺癌患者的生存结果显著相关。 ▶ ctDNA的组织溯源追踪 目前除了使用ctDNA作为液体活检来检测癌症的巨大兴趣之外，它也可以用于ctDNA的起源和肿瘤的定位。事实上，在每一种肿瘤组织和每一种组织中都有独特的DNA甲基化谱。因此，甲基化谱的差异可以识别ctDNA来源的组织。 据报道，一项研究开发了组织特异性DNA甲基化生物标志物，利用基于数字PCR的方法测量肝脏和结肠源DNA的血浆浓度，并探索其在转移性CRC研究中的临床应用。结果证实了肝脏特异性标记物在反映血浆中肝脏源性DNA浓度方面的准确性(检测HCC的特异性为93%，敏感性为60%)。 肝源性DNA的绝对浓度有助于有无肝转移的CRC患者提供了更好的区分。这些结果表明，ctDNA甲基化有助于肿瘤发生的组织溯源。 Cell-free DNA甲基化的研究方法 下表列出了市面上常见的DNA甲基化的检测方法
参考文献: [1] Luo H, Wei W, Ye Z, et al. Liquid Biopsy of Methylation Biomarkers in Cell-Free DNA [J]. Trends Mol Med, 2021, 27(5): 482-500. [2] Van Der Pol Y, Mouliere F. Toward the Early Detection of Cancer by Decoding the Epigenetic and Environmental Fingerprints of Cell-Free DNA [J]. Cancer Cell, 2019, 36(4): 350-68. |
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