磁珠是高通量测序过程中的必备产品之一，但实际应用中我们发现并不是所有人都了解磁珠工作的原理，今天我们以建库过程中最为常见的纯化磁珠为例，为大家介绍DNA纯化磁珠的工作原理。 磁珠是一种粒径为纳米或微米大小、具有超顺磁性的颗粒。所谓超顺磁性简单说就是在有外磁场时会呈现出弱磁性，撤去磁场后没有剩磁。磁珠通常由基质、磁性物质（四氧化三铁）、有官能团修饰的高分子材料组成。不同功能磁珠，其基质和表面修饰官能团不同。常用的基质有聚苯乙烯，具有很好的均一性和分散性，因此可操作性强，可以让磁珠像液体一样被处理，同时与目标分子接触面积大，因此DNA吸附和洗脱效率高。磁珠外表修饰有不同的官能团，高通量测序中常见修饰官能团有羟基、羧基、Oligo（dT）及链霉亲和素等，以适用于不同的类型的文库构建或生物学应用，而DNA纯化磁珠其表面修饰官能团就是羧基。
磁珠纯化核酸的原理一般是固相可逆固定技术（SPRI：Solid Phase Reversible Immobilization），在一定条件下核酸被选择性地固定在磁珠上，而污染物则留在溶液中，外加磁场后将吸附了目标分子的磁珠与溶液分离，然后清洗磁珠进一步去除污染物，之后在一定条件下将核酸从磁珠上洗脱下来，不同官能团修饰的磁珠，结合与洗脱方式不同。其中外表面修饰有羧基官能团的磁珠，在包含有PEG、高盐离子等纯化缓冲体系中，通过形成DNA-盐离子-羧基的离子桥而吸附DNA，这种结合是可逆的，在无PEG和盐离子的TE Buffer中离子桥被解除，最终达到纯化DNA的目的。
NGS测序由于技术的限制，测序读长较短插入片段长度一般为150~250bp，为了保证测序通量和满足后期分析需求，因此需要筛选合适大小的DNA片段。由于不同的磁珠投入量和纯化Buffer吸附片段大小不同，因此进一步也开发了DNA分选磁珠，拥有更稳定的片段筛选性能。磁珠会优先吸附大片段DNA，这是因为在一定浓度的PEG和盐离子体系中，片段更长的DNA会因失水暴露更多的磷酸基团，然后在盐离子如钠离子的作用下，优先与磁珠结合，而更小的DNA片段则不结合。片段筛选采用两轮吸附的方式，第一轮用磁珠吸附目的片段以上的大片段，保留上清；第二轮磁珠在上清中吸附目的片段，弃上清去掉小片段；最后将目的片段从磁珠上洗脱，以更精准的分选目的大小的DNA。
降低成本、提升通量是目前NGS的重要目标之一，而磁珠应用广泛、需求量大，早期依赖于进口试剂，进年来随着国内技术的崛起，各类国产化磁珠为低成本、高质量文库提供了更多选择。 除了前面说到的磁珠基质类型、磁性、修饰官能团种类、PEG及NaCl等这些基本要素外；比如基质厚度、孔容、孔径、比表面积等，再者官能团密度、臂长，所携带的表面电荷、斥力及氢键数量等，这些都会影响到磁珠的结合能力；另外就是磁珠残留，这除了和磁性有关以外，也和Buffer中的润滑剂如Tween-20的使用有关。 另外最重要的就是纯化得率和分选精确度了，回收效率高，分选精准的产品必然更受客户青睐。 |
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