带电的分析物的色谱分析往往具有挑战性，因为它们在常用的反相柱上不能有效保留，并在死体积中洗脱。在带有极性或水基固定相的色谱柱上，由于过度保留，峰形可能很差。 使用带电的固定相来分离带相反电荷的离子的离子交换柱很昂贵，只适合于小范围的分析物，而且分离效率有限。离子对色谱法（IPC）是一种适合于极性或离子性物质的色谱法的替代品。 1 什么是离子对色谱法？ IPC是一种离子色谱，用于在使用不带电荷的反相或「中性」固定相的色谱柱上分离亲水或带电的分析物。它包括通过与添加到流动相中离子对试剂的相互作用来改变带电分析物的极性。 这些试剂分子带有与分析物离子相反的电荷，它们能够与之形成静电键。分析物和试剂离子之间形成的配对就像中性、疏水的分子，可以在C18或C8柱上分离。IPC可用于分离极性有机酸、碱和齐聚物以及无机离子。 离子对试剂也被称为离子配对添加剂或异形体。由于这些分子有一个极性的头基和疏水的碳氢链，它们类似于肥皂（图1）。因此，这种技术在1973年由Göran Schill提出时被称为「肥皂色谱法」[1,2]。它也被称为离子相互作用色谱法，因为试剂离子与固定相相互作用以调节样品中存在的离子的保留。
图1 | 肥皂结构，非极性的亲油烃链和极性的羧酸盐头基在水的存在下显示 2 离子对反相色谱法与其他类型 的离子色谱法有何不同？ 离子色谱法（IC）广义上是指离子的分离，包括三种不同的机制，即离子交换、离子排斥和离子配对。当分离是由分析物离子和洗脱剂离子对固定相上带相反电荷的位点的竞争性作用带来的（图2），这种类型的色谱法被称为离子交换色谱法（IEX）。
图2 | IEX的分离机制，显示了带正电样品离子与带负电基团的相互作用
未解离、部分解离和完全解离的混合分析物可通过离子排除色谱法（IEC）分离，它也使用带电的固定相（图3）。流动相积聚在固定相的表面和孔隙内，导至「闭塞相」的形成。中性分析物被强烈地保留在闭塞相中，最后从柱子上洗脱出来。部分解离的分析物与被吸附的流动相之间的相互作用稍弱，因而较早洗脱。完全解离和带电的分析物被固定相（「唐南膜」）中带类似电荷的离子排斥，首先洗脱，完全在柱子的空隙体积内。
图3 | IEC中的分离机制，图中显示了中性物质通过唐南膜进入树脂相的过程 离子对反相色谱法是在非极性「反相」柱上通过向流动相中加入离子对试剂来进行的。例如，三氟乙酸用于与带正电荷的肽配对，而三烷基胺用于与阴离子如羧酸盐或寡核苷酸进行离子配对。 流动相离子色谱法（MPIC）是一个经常用于通过IPC分离小的无机离子的术语，然后通过抑制电导率测量来检测它们。这种技术适用于分析具有局部电荷的分子。 3 离子对色谱法的工作原理 几微升的样品溶液被注入反相色谱柱。当含有离子对试剂的流动相流经色谱柱时，分析物离子与带相反电荷的试剂离子相互作用，形成中性复合物，可在非极性固定相上分离。分析物的分离由离子对试剂、有机改性剂和任何添加到流动相的盐控制。 紫外线（UV）和荧光光谱法是IPC最常用的检测技术。其他技术的使用也有报道，如质谱法（MS）和电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）[3]。电导率测量是IC检测无机离子的一种成熟的方法，但较少用于IPC[4]。
图4 | 离子对反相色谱法的仪器 4 保留机制 人们提出了不同的模型来解释IPC中观察到的分离机制[5]。离子配对模型，也被称为分配模型，其中分析物离子和离子对试剂离子之间的相互作用被认为是在流动相中发生的。分析物离子与反离子一起形成一个非极性基团，可以吸附在疏水性固定相上。随后，通过增加流动相中的有机改性剂浓度，离子对复合物被洗脱（图5）。
图5 | IPC分离的离子对模型，显示在流动相中形成的离子对复合物 离子交换模型，也称为吸附模型，涉及离子对试剂分子的亲油烷基链在固定相上的吸附。被吸附分子自由极性基团对带相反电荷的分析物离子起着伪离子交换器的作用（图6）。
图6 | IPC分离的离子交换模型，显示了吸附在固定相上的分析物离子和离子对试剂离子之间的互动
离子相互作用模型，也被称为静电模型，其中当色谱柱与含有离子配对剂的流动相平衡时，被认为会形成一个电双层。 这些分子的非极性碳氢链会与柱子结合，极性基团形成一个固定的电荷层，而流动相中的离子对试剂的反离子则形成相反的电荷层。分析物离子与固定电荷发生静电吸引，能够穿透电双层。分析物分子和「带电」层之间的库仑作用导至固定相表面的电荷明显减少。 因此，一个离子配对剂的分子被吸附在固定相的表面以恢复电荷。综上所述，这可以被认为是分析物电荷和离子配对剂电荷，这两个相反的电荷在固定相上的吸附。
图7 | IPC分离的离子相互作用模型，显示了分析物离子、离子对试剂离子和固定相之间的动态作用 A）离子对试剂与固定相结合。 B）分析物离子穿透电双层。 C）分析物离子与极性基团结合。 D）一个新的离子对试剂分子与固定相结合。 5 影响保留的因素 在IPC中，有几个参数可以被修改以达到所需的分离效果。让我们考虑一些影响分析物保留的变量。 ➤ 离子配对剂的浓度：流动相中离子对试剂的浓度过高会导至分析物与柱子的结合过强，使其难以洗脱。另一方面，低浓度会导至分析物与柱子的结合不充分。因此，优化流动相中的离子对试剂浓度对IPC至关重要。离子对试剂对中性分子的保留没有影响，而它们会降低带类似电荷的分析物的保留，增加带相反电荷的分析物的保留。通常情况下，它们在流动相中的浓度保持在0.5到20 mM之间。 ➤ 有机改性剂的选择和浓度：像甲醇和乙腈这样的化合物被添加到流动相中，以调整化合物的保留，因为这些改性剂与离子对试剂和分析物竞争柱上的活性位点。有机改性剂会影响中性分子的保留以及离子对试剂的吸附，这又会影响带电分析物的保留。它们还能降低流动相的极性，帮助溶解疏水性的离子对试剂。 ➤ 柱平衡：柱子必须与离子对试剂充分平衡，以确保其在固定相上的吸附。 ➤ 柱温：柱温较高时，流动相的粘度会降低，从而使分离速度加快。 ➤ 流动相pH值：必须仔细控制流动相的pH值，以确保：a）分析物以及离子配对剂的电离；b）它们在柱子上的最佳互动和保留。pH值的调整在使用电导检测时也很重要。 ➤ 流动相添加剂：无机离子，如碳酸盐，已被证明会减少分析物在IPC中的保留。 6 离子对效应的作用 当电解质被添加到溶剂中时，它们解离成它们的组成离子并被溶剂分子包围。但随着溶剂极性的降低，离子的溶解度也会降低，由于静电吸引，它们之间的相互作用会增加。随着离子大小的增加，电荷密度减少，这也导至溶解度降低，与带相反电荷的离子的相互作用增加。离子上的电荷越大，带相反电荷的离子之间的库仑吸引力就越强。 离子对试剂有长的烷基链或芳基，不像具有高电荷密度的小离子那样有溶解性。因此，它们可以吸引并与带相反电荷的分析物离子配对。 此外，当离子对试剂被吸附在非极性固定相上时，它们的溶解度会进一步降低。这使它们能够与分析物分子形成「紧密」或「亲密」的离子对。这些离子对在两个离子之间没有任何溶剂分子。分析物和试剂离子上的电荷越大，它们之间的结合就越强。 7 选择一种离子对试剂 离子对试剂的选择也许是使用IPC时最重要的参数。试剂的类型，它的浓度以及与流动相和检测器的兼容性，都对分析物的有效分离起着重要作用。在为调查的样品选择离子对试剂时，必须牢记以下考虑。 ➤ 铵或四烷基铵离子（R4N+）可用于与阴离子配对。烷基硫酸盐（ROSO2O-）和烷基磺酸盐（RSO3-）通常用作分析阳离子的离子配对剂。 ➤ 构成试剂亲油部分的烷基、芳基或烷基取代的芳基链长会影响分离效果，必须针对所调查的分析物进行优化。 ➤ 亲水化合物，如氟化有机酸，如三氟乙酸（TFA）、氢氧化铵、氢氧化钠、硼酸、盐酸和高氯酸，被用作疏水阴离子的离子对试剂。 试剂必须能溶于有机改性剂。 8 优点、缺点和常见问题 尽管离子对色谱法与其他技术（如IEX和正相色谱法）相比具有某些优点，但它也存在缺点（表1）。在选择这种分离模式之前，必须仔细考虑这些优点和缺点。 表1 | IPC的优点和缺点
9 离子对色谱法的应用 IPC已被用于分析各种分析物，从环境样品、药品和食品到生物样品和金属。 9.1、环境分析 ➤ 阳离子表面活性剂，如十六烷基三甲基铵离子，和阴离子表面活性剂，如线性烷基苯磺酸盐，被用于制造洗涤剂、织物软化剂和清洁剂以及化妆品。阳离子和阴离子洗涤剂已经通过离子对高效液相色谱法（HPLC）同时测定了环境水样中的阳离子和阴离子洗涤剂，使用二正丁基铵离子作为离子对剂，然后进行电喷雾电离质谱检测[6]。 ➤ 曾经被认为是环境安全的有机溶剂替代品的离子液体已被证明对各种植物、动物和微生物有毒。因此，在环境样品中检测它们的敏感方法已经被开发出来。使用离子对反相C18柱和辛烷磺酸钠作为离子对试剂，实现了1-羟乙基-3-甲基咪唑（[HOEtMIm]+）和1-羟丙基-3-甲基咪唑（[HOPrMIm]+）阳离子的基线分离。该方法已被应用于检测河水样品中的羟基功能化咪唑离子液体阳离子[7]。 9.2、药品和食品分析 ➤ 为了研究药物的安全性、有效性和稳定性，它们与它们的代谢物一起被分析，通常是在生物基质中。反义寡核苷酸药物及其代谢物已通过离子对反相色谱法结合质谱检测法进行分析[8]。 ➤ 使用庚烷磺酸作为离子对剂，并在220 nm处进行紫外检测，开发了一种简单的、具有稳定性指示的HPLC方法，用于检测抗精神病药物阿塞那平。该方法已被应用于测定片剂中低浓度的阿塞那平[9]。 ➤ 加工食品以碘化物和碘酸盐离子的形式强化了碘。需要进行质量控制测试，以确保这些盐类在消费产品中的理想水平。通过使用1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐和咪唑离子液体作为离子对试剂以及紫外线吸收发色团，用反相HPLC分离并检测药品和饮料中的这些离子[10]。 ➤ 作为一种质量控制测试，离子对色谱法与电位检测法已被用于检测新鲜番茄、切碎的番茄罐头和番茄果肉中的生物胺含量[11]。 ➤ 氨基多羧酸（APCA）被用作药品、化妆品和食品中的螯合剂，以去除金属污染物并延长这些产品的保质期。一种离子配对高效液相色谱法被用来确定一种小分子药物中存在的APCA，如乙二胺四乙酸（EDTA），通过与铜的络合。另一种APCA，二乙烯三胺五乙酸（DTPA），在一个单克隆抗体中的存在是通过与铁络合并使用四丁基铵离子作为离子对试剂来测定的[12]。 9.3、生物分析 ➤ 为了了解黑色素色素eumelanin和pheomelanin的生物作用，使用四正丁基溴化铵作为离子对试剂，对其氧化得到的羧酸进行分离和分析[13]。 ➤ 进行氨基酸缩合反应是为了研究生命的起源。需要简单的分析方法来量化这些反应的产物。Campbell等人开发了一种离子对HPLC方法来分析甘氨酸及其低聚物（Glyn），最长可达14个残基[14]。 9.4、金属分析 ➤ 使用离子对HPLC在15分钟内分析了3种重金属--Co(II)、Cr(III)和Ni(II)--与2-吡啶间苯二酚（PAR）的螯合物[15]。 ➤ 放射性镥，Lu177，被用于研究和制造放射性药物。它是通过照射镱、Yb177或其化合物，然后与母体Yb分子分离而产生的。离子对反相HPLC已经被用来从10毫克中子辐照的YB2O2靶材中提纯Lu177，使用的是含有极性固定相的硅胶柱，如腈或烷基硅氧烷[16]。 硫酸盐被用于从矿石中提取黄金。在回收金属后，估计浸出液中存在的硫酸盐及其降解物，以确定该工艺的效率。硫酸盐、硫代硫酸盐和聚硫酸盐已经通过反相IPC与抑制电导率检测的方式在不同的黄金提取溶液中进行了测定[17]。 10 结论 几种色谱模式，如亲水作用色谱（HILIC）和IEX，以及不同类型的固定相，如离子交换或极性，已被用于分离带电和可极性分子。然而，IPC由于其简单性和可定制性，继续被用于分析它们。包括离子对试剂的选择、其浓度、有机改性剂和流动相添加剂在内的参数可以被优化，以实现预期的分离。 |
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