干货｜qPCR反应中所使用的的探针类型，都在这里！

有许多不同类型的荧光探针和引物化学试剂可用于qPCR，但大多数依赖于某种形式的共价连接的荧光淬灭基团分子，该分子在特定目标序列存在时被释放。

与嵌入染料不同，探针是特异性的，因此必须为每个检测设计，增加了检测设置的复杂性和成本。然而，这确实意味着它们也提高了检测的特异性。

不同的探针通过使用不同的荧光基团可以发出不同波长的荧光，因此只要选择了兼容的探针，并且设备拥有所需的过滤器，它们就可以被复用。

虽然最初的检测开发时间可能更长、更复杂，但多路复用可以通过在一个孔中进行多项测试来减少后续的设置时间和试剂使用。

常见的荧光探针包括：

水解探针，也叫TaqMan或5'核酸酶，是最常用的探针类型之一，水解探针包括一个序列特定的荧光标记的寡核苷酸探针，一端是荧光基团，另一端是淬灭基团。

当完整时，淬灭基团会抑制荧光信号。在目标扩增过程中，某些聚合酶的5'到3'外切酶活性会裂解探针，因此荧光基团不再靠近淬灭基团，从而产生荧光信号（图4）。

图4 | 水解探针的工作原理

荧光基团（R）显示为绿色，淬灭基团（Q）显示为紫色，目标DNA为灰色，扩增序列为黄色（粗线），引物为黄色（细线）。

与水解探针一样，分子信标是序列特定的荧光标记的寡核苷酸探针。然而，它们的两端附近有赠送的碱基（5或6个），形成一个发夹结构，使淬灭基团靠近荧光基团并淬灭信号。

当探针与目标序列结合时，茎部变性，使荧光基团和淬灭基团分开，从而产生信号（图5）。由于其结构，分子信标探针比水解探针更难设计。

图5 | 分子信标的工作原理

荧光基团（R）显示为绿色，淬灭基团（Q）为紫色，目标DNA为灰色，引物为黄色。

双重杂交探针也被称为LightCycler或FRET探针，这种技术使用一对探针，旨在结合相邻的序列，用供体荧光基团和受体荧光基团对标记，表现出荧光共振能量转移（FRET）。当探针与它们的目标序列结合时，供体和受体染料接近，发生FRET，受体发出荧光（图6）。

图6 | 双杂交探针的工作原理

供体荧光基团（R1）显示为粉红色，受体荧光基团（R2）为绿色，目标DNA为灰色，引物为黄色。

小凹槽结合剂（MGB）探针也被称为Eclipse探针，它们像水解探针一样在两端有一个荧光基团和淬灭基团。

然而，它们在淬灭基团附近也有一个MGB。在没有目标的情况下，MGB探针随机地盘绕，使荧光基团和淬灭基团接近。

当探针与目标物结合时，在MGB的帮助下，探针线性化，允许荧光基团发光（图7）。

图7 | MGB探针的工作原理

荧光基团（R）显示为绿色，淬灭基团（Q）为紫色，MGB为橙色，目标DNA为灰色，引物为黄色。

在这里，「探针」被称为UniPrimer。

UniPrimer的一端是荧光基团，另一端是淬灭基团，在未结合状态下形成一个发夹环，淬灭信号。

在第一轮扩增中，目标特异性引物对中的一个（称为Z引物）退火并延伸，产生一个产物。

在第二轮中，这对引物中的另一个引物附着在新形成的产物上并延伸以形成第二条链。

然后，它作为UniPrimer的模板，与Z引物序列结合。延伸导至UniPrimer展开，释放出淬灭的荧光基团（图8）。

图8 | Amplifluor检测的工作原理。

荧光基团（R）显示为绿色，淬灭基团（Q）显示为紫色，目标DNA为灰色，扩增序列为深黄色，引物为黄色，Z引物为黑色。

在这种方案中，其中一个引物也作为探针。

它在对立的两端有一个荧光基团和淬灭基团，形成一个茎环结构，当不与目标结合时，信号会被淬灭。一段与引物结合位点下游和扩增子内的区域相匹配的序列被纳入环路内。

在扩增过程中，该区域与其目标结合，导至环路断开，使荧光基团脱离淬灭基团的影响（图9）。

图9 | 蝎子探针的工作原理

荧光基团（R）显示为绿色，淬灭基团（Q）显示为紫色，目标DNA为灰色，扩增序列为黄色（粗线），PCR阻断剂为橙色，引物为黄色（细线）。

同样，基于LUX的检测的引物之一也充当探针，然而，与蝎子探针不同，它没有淬灭基团。

LUX引物的一端有一个荧光基团，采用发夹结构，本身就能淬灭荧光基团信号。当引物与目标物结合时，它变得线性化，解除了荧光基团的淬灭并产生了荧光信号（图10）。

图10 | LUX探针的工作原理

荧光基团（R）显示为绿色，目标DNA为灰色，扩增序列为深黄色，引物为浅黄色。

在QZyme检测中加入了一个底物，其中包含一个荧光基团和淬灭基团，并保持在接近的位置。

其中一个引物包含了能够裂解底物的催化性DNA区域的反义序列。一旦扩增，该区域就会裂解底物，将淬灭基团与荧光基团分离，产生荧光信号（图11）。

图11 | QZyme探针的工作原理

荧光基团（R）为绿色，淬灭基团（Q）为紫色，目标DNA为灰色，扩增序列为深黄色，引物为淡黄色，互补的催化区为粉色和黄色。

LocNAs是含有亚甲基桥的修饰核苷酸，限制了结构的灵活性（图12）。在探针序列中加入LocNAs可以提高特异性，便于使用较短的qPCR探针，对具有挑战性的序列有帮助。

图12 | 一个LocNAs

修改后的碱基在戊糖环的2′O和4′C之间含有亚甲基桥键（红色）。

本文节选自《qPCR简明技术手册》。