【综述】宏基因组高通量测序技术在革兰阴性菌耐药表型检测中的研究进展

抗菌药物耐药性（antimicrobial resistance，AMR）检测目前主要包括细菌耐药表型检测及细菌耐药基因分子检测。耐药表型检测技术主要为传统的抗微生物药物敏感性试验（drug susceptibility testing，DST）。DST是体外定性或定量测定抗菌药物抑制或杀灭细菌能力的实验。其常见方法包括稀释法（包括琼脂稀释法和肉汤稀释法）、纸片扩散法、梯度扩散法和自动化仪器法。细菌耐药基因分子检测技术是通过检测存在的耐药基因来推断耐药表型的方法，包括多重PCR检测及高通量测序检测。高通量测序（nextgeneration sequencing，NGS）是一种可以同时对数十万到数百万条 DNA分子序列进行读取的测序技术。NGS在临床中的应用越来越广泛，其中全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）和宏基因组高通量测序技术（metagenomic nextgeneration sequencing，mNGS）是较为常用的测序技术^［9, 10］。

DST是临床检测病原体是否存在耐药的主要手段，是确诊耐药病原体感染的“金标准”，但DST在细菌耐药检测方面仍有不足。首先，DST耗时长，临床无法快速获得细菌耐药信息，可能延误疾病诊疗^［11］。其次，DST在药物选择上存在偏倚性及滞后性。部分限制级抗菌药物（如多黏菌素、替加环素及头孢他啶-阿维巴坦）或新型抗菌药物不在常规DST目录中，只在患者疾病始终无法控制或者药敏显示全部耐药时补充纳入检测。最后，传统DST检测无法辨别耐药机制。部分耐药体外试验条件下可能显示敏感而临床实际显示耐药，导至耐药检测假阴性。通过检测耐药基因可能将体外表型阴性的耐药株筛选出来，故可以科学指导抗菌药物选择，避免重复更替同类型或同机制下的抗菌药物。此外，DST获得的药物体外高敏感不一定可以代表体内高敏感^［12］。分子检测如高通量测序则可以在一定程度上弥补这些缺陷来指导抗菌药物的精准使用^［13］。

高通量测序技术在临床的运用主要包括3种类型：WGS，mNGS及靶向基因测序（targeted next-generation sequencing，tNGS）。WGS与mNGS同属于无靶向的高通量测序。

WGS和mNGS均可用于微生物识别。二者不同之处在于WGS是对标本培养分离后的纯菌落进行基因组检测，获取全部基因信息；而mNGS则是对送检标本直接测序，获得所需要的基因信息。WGS可以提供整个基因组的全面信息，能协助发现基因序列存在的新突变，更多应用于研究耐药基因、毒力因子和微生物分型；mNGS则是从临床样本抽提基因进行测序和快速分析，比对数据库获取对应信息后辅助诊断已有疾病，广泛应用于感染性疾病诊断领域。从研究角度看，WGS可以视为筛选出“候选”耐药基因并加以注释的技术方法，mNGS则是对于检测出耐药基因的临床应用性技术^［14］。

测序技术通过对临床标本进行检测，将测序结果与已知微生物耐药基因数据库进行比对分析，筛选检出存在的耐药基因。目前已有大量可供获取比对耐药基因的公共数据库，如综合抗菌素耐药性数据库（CARD）、抗生素耐药基因在线（ARGO）、抗生素耐药基因数据库（ARDB）、抗菌药物肽数据库（APD3）、抗菌药物多肽收集（CAMP）、抗菌活性及多肽结构数据库（DBAASP）等^{［15, 16］}。

细菌对抗菌药物耐药的3种通用机制已得到充分研究：抗菌药物到达靶位点的穿透力下降，或靶位点处抗菌药物的外排增加；靶位点改变；水解酶使抗菌药物失活^{［17, 18］}。各种机制均存在与其相关的基因改变，编码水解酶的基因与细菌耐药表型的关系最为直接^［19］。革兰阴性菌存在的抗菌药物水解酶主要分为超广谱β-内酰胺酶（extended-spectrum beta-lactamase，ESBL）、耐碳青霉烯酶及头孢菌素酶^{［20, 21］}。不同水解酶存在各自相对应的编码基因。ESBL内常见耐药编码基因为TEM、SHV、CTX-M及OXA，还有部分少见基因如PER、VEB、GES、BES、SFO及TLA。碳青霉烯酶编码基因则包括IMI、KPC、GES、IMP、VIM、NDM、GIM、SIM及OXA，还包括新近发现的SPM、DIM、KHM、TMP等。头孢菌素酶编码基因则主要为AmpC，及少数碳青霉烯类耐药的亚型，包括CMY-2、ACT-1、DHA-1及ADC-68^{［22, 23, 24, 25, 26, 27］}。从分子检测角度分析，深入研究革兰阴性菌水解酶基因及其表型的相关性，可能更具有临床应用前景。

mNGS目前研究报道主要集中于致病微生物的诊断识别，对于耐药基因检测的研究尚不多见，已有研究报道提示mNGS在耐药基因检测具有临床应用潜力。Hasman等^［28］使用WGS直接检测尿液标本病原体及其耐药基因，结果发现直接检测样本所获得信息与药物敏感性实验及纯菌株WGS检测一致。Feigelman等^［29］发表了一篇肺囊性纤维化患者痰液标本的检测研究，将受检标本分为实验组（囊性纤维化）及对照组（慢性阻塞性肺疾病及健康人群）两组，然后分别进行传统微生物学培养及WGS直接测序，最终结果显示测序不仅可以提供更完整的微生物学信息，同时还能给予较准确的耐药信息。有研究者通过分析295份下呼吸道标本发现直接测序不仅可以准确、快捷显示呼吸道病原体，同时也发现抗菌药物耐药基因型与某些特定抗菌药物间存在密切相关性，展现了高通量测序技术在耐药基因检测相关方向的应用前景^［30］。鉴于WGS与mNGS在技术上的一致性，可以推测mNGS对于耐药基因型检测存在较高的可行性。目前将mNGS检出的耐药基因信息应用于耐药表型判断及抗菌药物方案制定的研究甚少，随着技术水平及临床医生对于mNGS认知的提升，mNGS在耐药基因检测及治疗药物选择中能够发挥更多的作用。

mNGS检测首先需通过解读测序结果判断出致病菌后才能进一步判断细菌耐药性。临床解读mNGS检测结果时，检测报告只为临床医生提供参考信息，而非最终诊断结果。最终结论只有在结合指南共识，立足临床实际，综合分析多种信息后方可得出^{［31, 32］}。

2021年初发表的《宏基因组高通量测序技术应用于感染性疾病原检测中国专家共识》对于mNGS用于细菌耐药检测提出意见总结如下：mNGS检测耐药基因建议用于无背景菌存在且采集过程未受污染的标本。同时建议检测存在菌种特异性的耐药性基因并将耐药基因准确定位到具体的病原体上以明确其临床价值^［33］。

临床实际情况复杂，例如呼吸道标本的mNGS检测耐药就无法完全满足指南推荐要求，但其对于临床治疗仍有很好的指导价值。临床mNGS送检多见于病情危重或感染反复未得到控制的患者，此时及时有效的抗菌药物使用将是治疗的关键；而mNGS可以快速提供关键信息。复杂病情让测序结果的准确判断更加依赖临床医生的科学解读。mNGS结果解读参数众多：测序质量（是否去除低复杂度、低质量序列等）、读长、特异性读长、覆盖率、深度、丰度、微生物序列的数据量、阈值等。目前临床最常使用的参数是检出序列数（reads），reads指特异且唯一比对到该病原体基因组上的序列数目，是一个以绝对值形式出现的相对值。序列数和样本量、样本中病原体的含量、核酸提取量、人源序列占比相关，在同一大类病原体（如同属于细菌大类）中，序列数越高说明该病原体存在的可信度越高。快速确定病原体，即可初步指导抗菌药物的选择。当综合分析一系列如耐药菌株产生的高危因素、检测到的基因类型、已检测到基因的地域分布情况及当地耐药流行病学等数据，抗菌药物使用的靶向性将大大增强。

mNGS检测出的耐药基因需要临床医生自己根据多种因素定位到具体病原体。例如当mNGS确定感染病原体为肺炎克雷伯菌，同时检测出存在耐药基因。首先需要考虑患者是否为高耐药风险人群，存在感染耐药菌株的危险因素如既往使用广谱头孢菌素类和（或）碳青霉烯类抗菌药物、机体功能状态差及自身免疫功能受损等。其次根据耐药基因与细菌种类间的相对特异性评估概率，SHV、TEM及CTX-M等ESBL表型基因和KPC、NDM-1等产碳青霉烯酶基因均为肺炎克雷伯菌常见耐药基因，其余如IMP、VIM、GES等则相对较少见^［24］。若存在高危因素且检测出基因为SHV、TEM及CTX-M中任一种，则可认为存在ESBL肺炎克雷伯菌可能性极大，可能需要直接使用碳青霉烯类药物。KPC或NDM-1基因应考虑耐碳青霉烯酶存在，应避免使用该类药物。再以铜绿假单胞菌为例，IMP、VIM、SPM及GIM基因广泛见于该菌种，而KPC、GES等则只有极少数亚型存在^［34］。耐药基因存在选择性细菌种属分布和地域性分布，但在检出KPC、OXA-48、VIM、IMP和NDM等耐药基因型，菌株易表现耐碳青霉烯类药物表型，且与种属和地区特征相关性较小^［19］。一旦检测出这些基因，都需评估患者使用含碳青霉烯类药物的治疗方案。

mNGS检测耐药基因目前依旧属于探索研究阶段，尽管该方向前景光明，但仍存在许多问题等待解决。首先，技术层面上mNGS存在核酸阅读序列相对较短（小于300 bp），难以获取耐药基因全长序列信息的缺陷。故有限的基因信息可能无法支持耐药基因亚型的深入分析，暂时局限于表面层次探索。例如D类β-内酰胺酶编码基因OXA共有100余种变异亚型，其中6种亚组（OXA-23、OXA-24/OXA40、OXA-48、OXA-58、OXA-143和OXA-51）具有不同程度的碳青霉烯水解活性^［35］。其余大部分为ESBL，及少部分仅能水解诸如青霉素类β-内酰胺类药物的亚组^［36］。检测无法深入到基因亚型可能会导至部分抗菌药物的过度使用。其次，mNGS全覆盖无偏移，结果易受标本类型及质量等因素影响。如慢性呼吸道疾病患者的送检标本可能会存在大量携带耐药基因的定植菌，mNGS无法判断耐药基因来源，此时可能误导临床医生的抗菌药物使用。故国内指南建议只有感染发生在正常无微生物定植的部位，才考虑在采用mNGS进行物种鉴定和耐药基因检测，并通过耐药表型试验进行验证^［33］。同时mNGS检测出的耐药基因可能无法精确定位至相应病原体，并存在基因-表型不完全匹配现象。目前对于革兰阴性菌的耐药基因测序，肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌及铜绿假单胞菌研究相对较多，已探索出菌种特异的高频基因型，但菌种之间存在基因转移，导至耐药基因与细菌的更加复杂的匹配联系。而且由于耐药表型与细菌种类、外界环境等多种因素相关，还存在多个基因共同协同表达某一耐药表型的情形，所以可能出现测序耐药基因为阳性但是表型却为对应药物敏感的现象^［37］。最后，mNGS对于细菌耐药只能定性却无法定量^［38］。mNGS检测出耐药基因只能代表存在某一种药物耐药的可能，细菌对于不同药物的耐药水平无法如传统药物敏感性实验以最低抑菌浓度定量化表达。此外，mNGS检测获得的基因信息只能提示对某一类型的抗菌药物耐药，无法得出具体药物信息。mNGS检测耐药基因结果的准确解读需要专业人员的协助，对于设备及人员要求较高，限制了其应用推广。

目前全球细菌耐药形式日益严重，快速及时获取疾病相关信息成为现今治疗的迫切需求，快速分子诊断技术成为未来新的趋势，基于耐药基因驱动的抗感染治疗也成为可行的新策略。mNGS作为一种不依赖培养的分子诊断技术，可以快速鉴定感染病原微生物、检出相关耐药基因，相比传统培养方法拥有更高敏感性又与“精准诊疗”的理念相契合。随着临床对测序技术深入研究和评价，mNGS指导下的精准抗感染治疗能够在感染性疾病诊治中发挥更大的作用。

参考文献（略）