啥黑科技？可10分钟完成核酸分子检测

在全球新冠疫情期间，时有媒体报道家庭自检神器的各种优势，特别是关于核酸分子检测的家庭自检产品，虽不是每一个都很惊艳，但总能引起一阵轰动。这些产品在媒体的宣扬下，总是显露出“以快制胜”的特点，从雅培的ID NOW^TM“最快5分钟确定阳性结果，13分钟确定阴性结果”，到先达的基因镜“技术突破，10分钟完成检测”。它们的“快”到底体现在哪？难道也就只有“快”这一特点吗？

01

雅培ID NOW^TM

1.技术原理

ID NOW^TM是雅培通过收购Alere后获得的检测平台，从其公布的甲/乙型流感病毒检测方法上看，该平台采用的技术为切口酶扩增反应(Nicking Enzyme Amplification Reaction, NEAR)，是一种基于切刻内切酶切割特性的恒温扩增方法，详细技术原理如下：

(1)设计一对含有酶切位点的引物，其5’端到3’端包含稳定区域、切刻内切酶结合/切割区域、靶标配对区域。反应过程中，引物的靶标配对区域与目标序列结合，并在DNA聚合酶作用下延伸扩增，从而引入切刻内切酶识别序列(图A中的1a~3a)。最后在上下游引物参与引发的合成过程中，形成两端含有切刻内切酶识别序列的双链DNA(图A中的4a~6a)。

(2)反应体系中添加有切刻内切酶(Nicking Enzyme)，该酶与限制性内切酶不同，其识别特定序列后，并不直接切断DNA双链，而是在其中的一条链上产生缺口，并暴露出游离的3’端，从而可作为引物，在DNA聚合酶作用下启动扩增，由切口处继续合成新链。同时，体系中的DNA聚合酶具有链置换功能，可置换出下游的DNA链(图B中的1b~2b)。

(3)被置换出的DNA链可作为模板，其3’端序列与引物的靶标配对区域结合，分别由5’端向3’端延伸，形成一端含有切刻内切酶识别位点的双链DNA(图B中的3b~4b)。

(4)一端含有切刻内切酶识别位点的双链DNA又可被切刻内切酶识别并切割，再次启动扩增并置换出下游DNA链，该单链DNA与另一条引物的靶标配对区域结合并延伸，同样形成另一端含有切刻内切酶识别位点的双链DNA，由此形成循环扩增过程，产生大量产物。

(5)反应体系中加入荧光标记的探针，可与扩增后的靶标序列结合并产生荧光信号。在一定时间内，ID NOW^TM会采集荧光信号，当信号到达设定阈值时则判定为阳性。

另外，雅培通过收购也获得了RPA专利，拥有这两项恒温扩增技术的专利，该平台或许可根据检测项目选择使用其中一种技术。关于RPA的技术原理，可查看充满想象力的恒温扩增技术:RPA、RCA、SDA、HDA，也可参考下文的ERA技术。

2.操作过程

ID NOW^TM的仪器在打开前盖后，里面有两个反应腔室，一个用于样本前处理（蓝色部分），另一个用于扩增检测（橙色部分），分别对应着检测试剂盒的两个组件：样本收集器(SampleReceiver)和检测基座(Test Base)。单人份检测试剂主要包含三个组件：其中样本收集器含有样本处理液，用于释放样本核酸；检测基座包含反应管，装有冻干后的扩增检测试剂；还有一个转移管(Transfer Cartridge)，用于处理后的样品转移，带有吸液和排液功能。具体检测过程如下：

(1)打开仪器盖子后，在扩增检测位置放上检测基座，仪器可扫描信息确定检测项目；再在样本前处理位置放上样本收集器，预热约3分钟。

(2)预热完成后，撕开样本收集器上的密封膜，用移液枪吸取200μL液体样本加入样本收集器中，或直接将采集后的拭子置于样本处理液中来回搅拌，释放核酸，该过程操作时间大概为10秒。

(3)将转移管扣于样本收集器上，自动吸取样本，再手工移动至检测基座上，扣上转移管，样品释放至检测管中，盖上盖子，仪器开始检测，并自动报告结果。

(4)反应结束后，将转移管-检测基座-样本收集器三者扣紧后丢弃。

从操作过程上看，人工操作步骤比较简单，总体检测时间也较短，但等待时间碎片化、操作步骤需人为衔接等过程，使得操作简便性略显不足。

02

先达的GENEYE^®

1. 技术原理

GENEYE^®（基因镜）是苏州先达基因科技有限公司最近公开的一款微型核酸荧光检测仪，搭配其自主开发的新一代核酸检测技术(New ERA)，可实现全程10分钟的现场化检测。其扩增方法酶促重组扩增技术(Enzymatic Recombinase Amplification, ERA)是一种类似RPA的恒温扩增技术，详细反应原理如下：

(1)反应体系中的特异性上下游引物分别与重组酶等蛋白结合形成复合体后，将扫描双链DNA模板，搜索与引物同源的靶标序列。

(2)复合体识别并定位至同源靶标序列后，重组酶解开双链结构，并使引物置换出模板的互补链，同时单链结合蛋白结合至被置换出的单链DNA上，稳定单链结构。

(3)在ATP水解供能下，重组酶解离暴露出引物3’端，DNA聚合酶随即结合至引物上，启动DNA扩增。

(4)DNA聚合酶延伸过程中，同步解开DNA双螺旋结构，合成新的扩增产物。

(5)产物同样可作为模板参与扩增，在重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶等相互协作下产生大量扩增子。

ERA的最适反应温度为37~42℃，是一种体温扩增技术，对仪器温控系统要求较低。多个酶作用下，促使反应体系在恒温条件下快速扩增，使得痕量核酸模板扩增到可检出水平。先达基因基于ERA技术开发了常规电泳检测、实时荧光检测和试纸条可视化检测等多种快速检测试剂；同时开发了免提取的核酸释放剂，用于样本的快速处理；也基于其单分子荧光检测技术，研发了集恒温扩增与荧光信号检测于一体的荧光恒温扩增仪。可能正是基于这些核心技术，才汇聚成就了一款简单快速的小型化检测设备。

2.操作过程

基因镜非常小巧，重量仅为200g，可通过手机连接后，在手机APP上操作并获取结果。其对应的检测套装组成也很简单，包含一个检测管和一个样本管。具体操作过程如下：

(1)接通仪器电源后，将手机与仪器连接。

(2)取出检测套装中的样本管，加入拭子并拧上盖子后，手动挤压拭子头，使得样本与处理液混合。

(3)将上述处理后的样品直接滴加至检测管中，并置于仪器上，再通过手机APP启动反应，检测完成后可于手机APP上查看结果。

基因镜的操作步骤较少，简单说明后即可使用。而智能手机APP的应用，更是推进了分子试剂实现居家检测的关键一步。

03

关于家庭自检产品的思考

1.快，是共同特点！

该两款产品在行业内为人所关注，均是以其“快速检测”的特点被广泛传播。那它们到底“快”在哪里呢？

其快之一首先体现在扩增检测上，两款产品采用的扩增技术均为恒温方法，减少了PCR需要通过温度变化控制循环扩增的过程，技术本身具有先天优势。恒温扩增反应的温度一般为中低温，IDNOWTM平台的NEAR反应温度为54~58℃，基因镜的ERA最适反应温度为37~42℃，也可于室温下反应，对温控的要求远低于PCR，这一方面可简化仪器，另一方面也能减少能耗，易于实现家庭自检设备的搭建。

在解决核酸扩增检测时间长的问题后，简化操作流程便是另一大限速步骤，特别是在样本前处理过程上。可以看到，上述两款产品在样本处理上无一例外地选择了免提取步骤，均采用样本处理液将核酸释放后，直接取样检测，大大减少了人工操作时长，也降低了操作难度。不过，若以家庭自检产品的定位看，ID NOW^TM操作流程还不够简便，间歇式的人工操作，大大降低了其体验感。

2.快，就够了吗？

只是，对于家庭自家产品，难道只要“快”，就足够了吗？或许，还是有不少人会追问：准吗？灵敏度咋样？贵不贵？

特别是，当分子检测的样本前处理过程简化了之后，总是让人不禁担忧其检测结果的可靠性。很多时候，为了满足快速简单的检测过程，在样本前处理上，不是在“简”流程，而是在“减”步骤。“简化流程”是基于保质保量的前提下优化产品，“减少步骤”则难免以牺牲产品适用性、准确性和灵敏度为代价。

准不准？这个问题从核酸扩增反应原理上是可解决的。只要设计合理，通过优化反应体系，准确性不是主要问题。

灵不灵？从样本处理方法上看，快检产品的检测灵敏度确实不及常规分子诊断产品。免提取无法完全去除抑制物、样本释放剂无法浓缩富集核酸，这都会使快检产品的检测灵敏度大打折扣。尽量减少抑制物的引入量、提高反应体系的抗干扰能力，灵敏度也同样可达到满足市场需求的水平。

贵不贵？主要还得看市场需求。前面提到的恒温扩增方法对仪器要求较低，因此设备制造成本可能相对较低。但是，恒温扩增所需的酶原料又普遍比传统PCR酶贵，因此试剂成本则不一定低。不过，参考PCR原料的供应情况，以及轰轰烈烈的集采过程，当恒温扩增检测产品市场需求量足够大时，其上下游产业形成规模后，成本自然有下降空间。也就是，只要市场有需求，企业降本依然有动力。

简捷又有用、快速又便宜，或许就是家庭自检产品最终的目标。而这漫漫长路中，已有人走出了第一步，未来依然可期。