qPCR染料法 在PCR反应体系中，加入过量的SYBR Green I荧光染料，该染料只与双链DNA小沟结合，并不与单链DNA链结合，且在游离状态不发出荧光，只有掺入DNA双链中才可以发光。因此，在PCR体系中，随着特异性PCR产物的指数扩增，每个循环的延伸阶段，染料掺入双链DNA都会发出荧光，其荧光信号强度与PCR产物数量呈正相关。
qPCR染料法 每个模板的CT值与模板起始浓度的对数存在线性关系，起始浓度越多，CT值越小。利用已知起始浓度的标准品可做出标准曲线，其中纵坐标代表起始浓度的对数，横坐标代表CT值。根据待测标本进行荧光定量得出的CT值，即可从标准曲线上计算出该标本的起始浓度。
标准曲线 熔解曲线是为了验证扩增产物特异性，如果熔解曲线是单峰（80~90℃之间）说明产物只有一条，结果较好；如果是双峰（70~80℃、80~90℃之间均有峰），说明产物不特异，可能存在引物二聚体或非特异性扩增。
正常样本熔解曲线
异常样本熔解曲线 qPCR探针法
qPCR探针法
荧光定量CT值 目前，随着新冠疫情趋势的发展，国内既要防控境外输入，又要应对本土新增病例和无症状感染者。核酸检测已成为诊断新冠病毒感染最可靠的一种方法。核酸检测由于qPCR染料法不能特异性识别DNA片段，所以最好的技术是RT-qPCR探针法。 RT-qPCR：新冠核酸为RNA病毒，在PCR反应之前，需要将单链RNA转cDNA，再进行qPCR反应。在实验室当中，为了达到实验简单快速的目的，通常使用一步法，在PCR反应体系中，直接加入逆转录酶进行荧光定量PCR反应。这种方法是RT-PCR与qPCR的结合。 新冠病毒核酸检测为定性实验，只需要根据qPCR的CT值即得出位点检出与否。目前，新冠病毒核酸检测位点主要包括病毒基因组中3段保守基因序列，即开放读码框1ab（Open reading frame 1ab，ORF1ab）、 核 壳 蛋 白（Nucleocapsid protein，N）基因以及包膜蛋白(Envelop，E)基因作为检测靶标。根据国家卫健委发布的新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南（第二版），在实验室要确认一个病例为阳性，需满足同一份标本中新冠病毒的ORF1ab及N基因 2个靶标特异性实时荧光RT-PCR检测结果均为阳性。
图片来源：国家卫健委官网 阴性：无Ct值或Ct值>40。 阳性：Ct值<37，可报告为阳性。 可疑：Ct值在37-40之间，建议重复实验，若Ct值<40，扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性。 信息来源：国家卫健委官网、个人图书馆 |
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