解析：实时荧光定量PCR产品质量标准要点！

懂得人都知道，PCR技术以其灵敏性、特异性和快速性在医学和分子生物学等领域得到了广泛的应用。近年来出现的核酸定量PCR技术，尤其是实时荧光定量PCR（FQ-PCR）技术，实现了PCR从定性到定量的飞跃，以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为分子生物学研究、医学研究和疾病诊断中的重要工具。我们在研发调试中对FQ-PCR试剂有那些技术要点和质量标准呢？下面就和大家讨论一下。

1.FQ-PCR技术的基本原理

文献上这样解释：FQ-PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在FQ-PCR中，对整个扩增过程进行实时监测和连续分析，随着反应时间的延续，将荧光信号的变化绘制成一条曲线。一般而言，荧光扩增曲线可分为3个阶段:荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台阶段。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化。而在平台阶段，扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR的终产物量与起始模板量之间无线性关系，不能根据最终的PCR产物量计算起始DNA拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在该阶段进行定量分析。

2.FQ-PCR的关键参数

①荧光域值（Threshold）:以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，一般荧光域值定义为3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。

②循环阈值，Ct（Cyclethreshold）值。Ct值是指样品管的荧光信号达到设定阈值的PCR反应循环数。即荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。在实际操作中，该节点即为每个反应管内的荧光信号到达设定的域值的时刻，可见Ct值取决于阈值。③ΔRn:是指模板DNA的起始拷贝数。Ct值与ΔRn成反比。

3.FQ-PCR技术要点

3.1样本制备：根据诊断的需要选取特定的样本用来进行FQ-PCR，使用样本的来源较为广泛，有尿液、血清、拭子样本、粪便等。将采集的样本置于灭菌试管中，密闭送检。样本可立即用于检测，也可于-70°C保存，但不宜反复冻融，应采用低温运送。冻存样本使用前应在室温融化并充分混匀，取适量待测样本，按比例加入核酸裂解液，按试剂说明书制备核酸样本。阴性质控品、阳性质控品及定量参考品进行同步处理。

3.2PCR扩增：PCR反应混合液经室温融化并充分混匀后，2000r／min离心10s，取适量加至PCR反应管，分别加入处理后的阴性质控品、阳性质控品、定量参考品，盖紧反应管，8000r／min离心数秒，将各反应管按顺序放至PCR扩增仪，按说明书规定程序进行PCR扩增。

3.3数据分析：反应结束后，根据图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值（可根据实际情况自行调整，Start值可以在3～15、End值可设在5～20，调整阴性对照的扩增曲线平直或低于阈值线），进行分析，观察结果，记录Ct值和定量结果，应符合以下要求：阴性质控品：检测通道扩增曲线无对数增长期；阳性质控品：检测通道扩增曲线有明显对数增长期，呈典型S型扩增曲线，检测浓度在某一范围内；定量参考品：均检测为阳性，且标准曲线相关系数R2≥0.98。以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。

一般认为高于荧光阈值的荧光信号是可信的，可以用于定义样本的Ct值。通常用不同浓度的标准样品的Ct值来绘制标准曲线，计算相对方程式。方程式的斜率可以用来检查PCR的效率，所有标准曲线的线性回归分析需要一个高相关系数（R2>0.98），以保证实验的过程和数据是可信的，通过该方程式计算出待测样本的初始模板量。FQ-PCR仪可通过软件自动计算出待测样本的初始模板量。

3.4其他影响因素：FQ-PCR结果的影响因素有很多。样本检测结果与样本收集、处理、运送及保存有关，其中任何失误均会导至结果不准确。例如实验中的交叉污染，可能导至假阳性结果出现。实验过程应严格分区进行，所用消耗品应灭菌后一次性使用，实验操作的每个阶段应使用专用的仪器和设备，各区各阶段用品不能交叉使用。所有检测样品均应视为具有传染性的物质，实验过程中应穿工作服，戴一次性手套并经常更换手套以避免样品间的交叉污染；样本操作、废弃物处理均需符合卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通用准则》和《医疗废物管理条例》的相关要求。所有的试剂在使用前，均需在室温下充分融化、混匀后使用。

4.FQ-PCR产品质量标准的建立

4.1FQ-PCR产品质量控制关键点

实时荧光定量PCR检测产品通常由核酸提取试剂、PCR检测试剂、质控品等组成。这些是该类产品关键技术点，也是其质量控制关键点。制定FQ-PCR产品质量标准应围绕这些关键点进行。

4.2质量标准建立

4.2.1外观和物理性状：外观和物理性状以及试剂外包装的完整性，是对所有试剂进行检测的第一步，也是直观的检测指标。一般来说，试剂（盒）包装应完整，无破损，液体无渗漏。试剂融化后，溶液应澄清，无明显沉淀，无悬浊物。

4.2.2阳性参考品符合率：阳性参考品1套，至少应包含2～5种不同来源的、各自有独特代表性的阳性样本，如不同人群、不同感染阶段、同种病原微生物的不同亚型，特别应注意强阳性样本、弱阳性样本和临界阳性样本的选择。评价试剂盒的阳性参考品符合率的理想情况应为100%，若出现阴性，应视具体情况具体分析。

4.2.3阴性参考品符合率：阴性参考品一套，一般应不少于10种不同来源的，相对于该项测定是阴性的样本，应包含：不同年龄组、不同人群、同种病原微生物的不同亚型、基因结构相似的不同病原微生物、临床症状相似的不同病原微生物等。评价试剂盒的阴性参考品符合率的理想情况应为100%，若出现阳性或弱阳性，应视具体情况具体分析。

4.2.4灵敏度：通常灵敏度通过最低检出限来反映，是评价试剂盒质量的重要技术指标，因为极少量的分析物可能对界定疾病状态、疾病筛查或揭示是否存在有毒物质、污染物质、传染病病原体等具有重要意义。

4.2.5精密度：精密度是评价试剂盒对同一样本重复测定时能否得到相同结果的指标，通常用变异系数（CV）表示。精密度是指同一批号试剂对同一样本重复测定（10次），CV应不大于10.0%。对于FQ-PCR来说，同一精密度参考品需分10次分别进行样本制备（包括核酸提取），经PCR扩增，再进行精密度分析，结果应符合规定。

5.FQ-PCR的实际应用

目前，FQ-PCR的商品化产品已相继出现，并广泛应用于遗传性疾病诊断、病原体检测、耐药性分析、肿瘤等疾病的诊断及其预后观察中，下面将以乙型肝炎病毒核酸国家参考品和甲型H1N1流感病毒核酸国家参考品质量标准为例，对目前常见的FQ-PCR试剂质量标准检测项目进行分析，质量标准见表1（略）。

通过肉眼观察产品外观和物理性状，是产品质量控制最基本的，也是重要环节之一，本文不作详细叙述。阳性参考品和阴性参考品分别用3家以上国内外试剂初筛，再选用3种以上试剂经两次以上检定，从中选取共同阳性血样和共同阴性血样。HBVDNA阳性参考品包括强阳性血清3份，中等强度阳性血清4份，弱阳性血清2份；甲型H1N1流感病毒阳性样品包括国外标准株，也包括国内分离株。阴性参考品既包括病毒结构类似的病毒，如季节性甲型流感病毒，还包括临床症状类似的病毒，如呼吸道合胞病毒等。

精密度评价，甲型H1N1流感病毒参考品选用1份阳性样本作为精密性参考品。HBVDNA参考品选用1份强阳性血清，用阴性血清对其进行6次10倍系列稀释，获得7份参考品（编号L0～L6），用WHOHBVDNA标准品对其进行定量标定，确定7份参考品的浓度，其中L0～L5为定量线性参考品，质量标准要求测定结果应在其靶值范围内，且R2≥0.97。数据分析可见，测定结果在靶值范围内，各R2值均≥0.97，如果L0～L5中某个样本测定结果不在靶值范围内，线性相关系数则＜0.97。因此，HBVDNA定量线性参考品是通过将1份样本系列稀释，其测定结果均应与稀释倍数符合线性比例关系，以此对试剂盒精密度进行评价。因此，对FQ-PCR试剂盒进行精密度评价有两种方法，一种方法是确定1份阳性样本，同一批号试剂对该样本重复测定不少于10次，CV≤10.0%；另一种方法是确定一套定量线性参考品，要求测定结果在其靶值范围内，且线性相关系数R2≥0.97。另外，在注册检验中发现，将精密度参考品分别进行核酸提取、PCR扩增等步骤，检测结果浓度值（拷贝数／ml）的CV较大，而检测结果Ct值的CV较小。以某厂家的单纯疱疹病毒（HSV）II型核酸定量检测试剂盒精密度检测数据为例，检测结果见表2，分析发现，CV值以浓度值计算可以较真实的反映试剂盒的精密度，以Ct值反映则不显著。

最低检出限（灵敏度）是质量控制的一项重要指标，同时也能较精确地反映病毒治疗效果，具有重要意义。以甲型H1N1流感病毒核酸国家最低检出限参考品为例：将灭活的A／Beijing／SWL5／2009（H1N1）病毒培养液倍比稀释，制备系列梯度参考品S1～S5。协同标定结果表明，在S1～S3范围，Ct值与稀释倍数符合线性比例关系，S3～S4进入平台期，Ct值与稀释倍数已不符合线性比例关系，即相近的Ct值对应的稀释倍数差异较大。因此，甲型H1N1流感病毒核酸国家最低检出限参考品将S3设定为最低检出限。

PCR敏感性和特异性较强，具有较高的临床诊断价值。随着PCR及相关技术的迅速发展，对该技术提出了新的要求，如用于疗效评价和基因表达调控研究等。在PCR技术基础上进行基因定量分析是未来基因诊断的发展趋势。目前，国内外已有各种定量PCR试剂逐渐问世，建立FQ-PCR方法的质量标准，对其检测结果进行严格标准化，对推动该技术在临床诊断应用中的规范化具有重要意义。