IVD技术丨CRISPR简史与其他

大家好啊，我又来了！今天我来讲讲CRISPR技术简史与其他。

大家知道啊，去年的诺贝尔奖发给了CRISPR基因编辑技术！其实就是一个怎么改物种DNA的技术。

那什么是DNA？DNA是生命的遗传物质，是生命体生老病死的蓝图。而本质上又是非常简单的ATGC 4个碱基字母的排列。人大约是30亿个字母！

DNA的字母或者文字一样，可能有各种突变，有些突变没事，有些突变那可能就改变含义了！可能是错字，可能是少字了，也可能多了废话需要删掉！那基因编辑就是去增、删、改细胞里面的DNA。

文字修改相对容易，而DNA这种纳米级别的修改不是那么容易。除了CRISPR之外，之前还有一些基因编辑技术，所有的技术基本原理类似，都是要找到要修改的地方，先剪开！然后呢，有两种可能，一种就是断开的地方，细胞直接修复，叫NHEJ修复，这种方式往往会造成缺失或增加，导至基因失活。另一种是要加同源重组的模板，可以实现精确的修复。有人说，同源重组精确怎么还有NHEJ。实际上，不少基因失活的研究，NHEJ更方便，效率更高，这种突变就会造成整个基因的失活。

就像这句话一样，缺失突变的移码会造成整个意思的变化。

具体来说，今天下面这些就是我将介绍的内容。如果非要将基因编辑技术设定一定代次的话，那第一代是归巢核酸内切酶（也有人不给它归类，因为不好用）；第二代是锌指蛋白；第三代是TALEN；第四代是CRISPR技术，目前大部分实验室和公司用的是CRISPR技术，简单易用。在CRISPR技术中，目前也有对其改进的各种版本。以及呢，也会介绍下CRISPR除了编辑还能做些什么？

第一代是归巢核酸内切酶(Meganuclease)是具有较大识别位点（12至40个碱基对的双链DNA序列）特征的脱氧核糖核酸内切酶，该酶的切割位点在基因组中通常只出现一次。尽管自然界中存在数百种归巢核酸内切酶，但能够在所需位置切割给定基因的归巢核酸内切酶的可能性非常小。

有些人可能通过改造，或者一些迂回的办法，但总的来说就是不好用。

第二代是锌指蛋白（zink finger）。长得像手指，很多人认为像手指一样的蛋白才应该叫锌指蛋白，但现在这个定义早已被不断发现的同类蛋白质给扩大化了。锌指蛋白一般指的是所有需要结合锌才能正常行使功能的一类蛋白质。锌指蛋白没有固定的结构和作用，他们一般在调控基因表达，稳定结构方面发挥作用。

锌指核酸酶包含由锌指蛋白组成的DNA结合域和由具限制性内切酶活性的FokI组成的DNA切割域两部分。每个锌指蛋白可通过它的α螺旋特异性地识别三联体碱基。DNA切割域的FokI一般需要以二聚体的形式以非特异性地方式切割DNA，会造成DNA双链断裂。

第三代是转录激活因子样效应物核酸酶TALEN，它是一种可精确靶向切割特异DNA序列的核酸酶。它也是由两部分组成，N-端是特异识别目的DNA序列TAL效应子，C-端是来自FOKI的切割domain，能够做到对A，T，C，G一一对应的精确识别，实现对基因组任意位点的靶向识别编辑。对TAL效应子附加一个核酸酶就生成了TALENs。TAL效应核酸酶可与DNA结合并在特异位点对DNA链进行切割，从而导入新的遗传物质。

可以看到，前三代要去切割特定的位点，需要改蛋白，这就比较麻烦。我们来看看新一代的CRISPR技术。

CRISPR的故事始于1987年。当Nakata和他的同事在研究大肠杆菌iap基因时，发现在它的下游含有一组29个碱基的重复序列，但这些重复序列与典型的重复形式不同，即在这种重复序列中间含有32 nt的非重复序列，俗称间隔重复。但是，最初并不知道这些重复序列的功能。

在接下来的10年中，人们在越来越多的微生物中发现了这种结构的序列；Mojica和他的同事总结了所有测序的微生物，发现超过40%的细菌和90%的古生菌含有类似结构的序列。这些重复序列的附近也有一些相关的蛋白。

直到2005年，经过系统分析后发现间隔序列（spacer）可能是来源于外源染色体和相关噬菌体的序列。另外，有研究发现病毒不能感染某些古生菌，这些古生菌的spacer来源于病毒的DNA片段。这些证据使得人们推测，CRISPR具有免疫记忆和防御的功能，spacer通过核酸碱基配对的方式预防侵染的噬菌体。

2011年，Siksnys和他的同事第一次证实了type II CRISPR系统可以从嗜热链球菌中转移到大肠杆菌。随后的2012年，Charpentier/Doudna和Siksnys独立在体外证实了Cas9能在体外进行切割，而且单个RNA（sgRNA）即crRNA和tracrRNA融合的形式同样可以在体外发挥活性。

2013年，张锋和George Church两个实验室分别Cas9成功地在哺乳动物细胞中进行基因组编辑。

在此之后，基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术受到了广泛的研究和应用，并且发展出了许多基于Cas9的应用工具。

当然，初始版本的CRISPR/Cas9技术还是有一些问题存在，其中一个问题就是脱靶问题，也就是说，会去错误切割其他非目标的DNA位置。所以，人们就开发出各种改进的办法。比如，这里，dCas9-FokI或者nickCas9，这样可以识别两段都正确才会被完整切开。

或者有根据修改一些关键位点，提高正确靶标结合能力而减弱非靶标能力，比如eCas9，Cas9-HF。

另外，还开发出了碱基编辑器 。Cas9和碱基修饰的结构域结合，这样就无需把DNA切开了。

最近，还有Prime编辑使用Cas9 nickase融合逆转录酶。这种融合与修饰过的引导RNA一起使用，该引导RNA被延长以包含RT引物结合位点和包含所需编辑的RNA模板;整个引导复合物被称为PRIME编辑引导RNA或pegRNA。pegRNA和nickase Cas9-RT融合的结合影响了细胞中的DNA修复机制，通过复制RNA模板并将其替换到目标位点，将编辑物合并到所需的位置。

2019年，麻省理工学院的张锋实验室和美国哥伦比亚大学的Samuel H. Sternberg实验室分别应用了新的CRISPR转座酶系统，该系统可在向导RNA的引导下实现大片段DNA在细菌基因组中的定向整合。新系统具有极高的特异性且整合效率高，为原核生物的大片段DNA定向整合提供了更多可能。

CRISPR除了基因编辑，其实还有不少应用领域

相信不少人对蚊子都十分讨厌，但你也许不知道它还是人类的“第一杀手”。蚊子传播的平均每年会导至725000人死亡。

有科学家发明了一种新的灭蚊方法，通过基因驱动改变蚊子的性别，使其后代主要是雄性，从而使蚊子数量锐减并降低其传播疾病的能力。因为只有雌性才会叮咬和传播疾病。

改变蚊子后代性别比例的原理是在精子产生的过程中利用DNA切割酶，CRISPR蛋白破坏染色体，从而产生以雄性为主的后代群体。

CRISPR基因文库筛选是用来精准筛选出所需要的功能基因。基本原理是通过大量的gRNA指导Cas核酸酶对靶向基因进行DNA切割，以此造成各个基因的功能突变或缺失。然后在此基础上，利用富集以及随后的扩增和深度测序分析，发掘与筛选表型相关的基因。

另外，将Cas9的切割活性位点突变后，虽然失去切割活性，但仍然保留sgRNA使其靶向到特定DNA的功能，这个蛋白叫做dCas9，或叫做dead Cas9。这种Cas9蛋白切不了片段，但是呢，仍然可以靶向到特定的DNA序列上结合。这样子的话，如果将dCas9融合特定功能的结构域，就可以进一步的开发出各种工具。比如，可在dCas9上融合特定的效应结构域，应用于基因调控（激活或抑制），表观基因组编辑，或与荧光蛋白融合，使得可以在活细胞中直接成像基因组的特定位置。

CRISPR蛋白特异性识别DNA位点，并切割开片段的工具，那是不是可以拿来直接体外切割片段用呢？没错，比如，用Cas12a蛋白可以切割形成粘性末端，并且可以人工设计crRNA，几乎可在任何想要的地方切割。那就可以替代普通的限制性内切酶。这里有一个例子，就是用Cas12a切割，T4连接酶连接，拼接能够表达出有个蛋白的DNA序列，图上照片就是拼接出来的各种各样颜色的大肠杆菌。没错，这是我画的，还附上了署名。

CRISPR核酸检测是另外一个领域。因为Cas12或者Cas13结合特定靶标核酸之后，会切割体系中的探针核酸，从而可以测到荧光或者试纸条方式。像之前，张锋公司用这种方法测新冠。

CRISPR系统中，除了Cas9,Cas12这些蛋白。还有像Cas1和Cas2蛋白也是CRISPR系统的成员，Cas1-Cas2是用于抓取和记录外源入侵的DNA的。那么我们是否可以作为工具用呢？当然可以，科学家利用CRISPR技术，将一张“马赛克动图”编码植入到了活性细菌的 DNA 中。

注意：同样地，这个图谱没有经过详细确认，错误和遗漏在所难免。这里仅供参考！

技术上

前3代的基因编辑方式虽然也能用，但不易开发迭代。因此，少数已有研发基础的公司会做，将来估计几乎不会有其他公司再参与。

CRISPR的技术易用性和设计灵活性，绝大部分实验室和将来的公司都会采用这一技术。

未来CRISPR技术发展方向

防脱靶：对CRISPR防脱靶已有诸多策略，大致可分为4类：

（1）理性或非理性优化Cas蛋白，

（2）寻找新酶，

（3）sgRNA上的预测和设计，

（4）nickCas或dCas融合其他功能性结构域。其中Prime editing我最看好。

测序：单细胞测序，研发和实际应用阶段，将进行测序验证脱靶率。

PAM：对PAM拓展编辑的限制是需要的，但我认为不会花主要精力。

巨头

医药巨头内部研发会非常谨慎。对于不确定性较高的方向，倾向于收购（这对于他们来说也是省钱的策略），预计还会有不少收购。收购成功后，将自行大量研发。

国内情况

国内的公司数量和质量上明显落后于国外公司。原因：

（1）独创专利技术开发稀少；

（2）医疗前期需要巨大资金，风险大；可能国内投资机构和科研人较难承担此风险。

国内有很多CRISPR服务于科研的公司，能加速科研研发（也能挣些钱），但这不酷。

未来

两个关键点：

（1）有1例广泛使用的商业化基因编辑产品；

（2）CRISPR技术专利将来放开。将会有一大批创业公司进一步涌现。