诊断技术｜真核生物的DNA

在上一篇文章当中，我们介绍了细菌、古细菌和病毒的DNA情况，今天，我们将介绍真核生物的DNA情况。

在真核生物中，基因组双链DNA与组蛋白和其他结构蛋白通过缠绕和缩合的方式联系在一起，形成染色体（图1）。

图1|从分裂期的染色体到DNA双螺旋结构

a 带有细胞核的真核细胞。相间期的染色体位于细胞核内，只能看到浅色或深色的结构，分别为优染色质和异染色质。细胞核单独可见。

b 核型。在有丝分裂的分裂期，当核膜消失后，可以用光镜用特殊技术观察到各个染色体的排列，在有丝分裂的蜕变期，核膜会消失。在插图中，显示了人类男性的单倍体染色体数目。

c 每条蜕变期的染色体都有一个相同的组织。它的宽度约为1400纳米。染色体可以在不同的阶段被解开，染色质会形成出凝结的异染色质染色体，它是由染色质线构成的，这些线含有凝结的核糖体，主要由组蛋白组成，周围有两个缠绕的双链DNA。只有未被包裹的DNA（euchromatic）才能具有功能活性，图中可以看到不同的未包裹的元素的大小。

在活跃分裂或静止细胞的间期（G0期），染色体被锁在细胞核内。当DNA被复制或转录时，它是（完全或部分）松弛的（异染色质）。

它所占据的空间比不活跃的异染色质大得多，异染色质由高度堆积的DNA蛋白复合物组成，不能被转录或复制。在有丝分裂的细胞核中，核膜消失（暂时的），染色体是最大的异染色质，并浓缩到最小长度。

所有的染色体都可以通过核型来单独识别：对有丝分裂期染色体的显微镜分析（图1）。

每个物种的核型都是独一无二的，真核生物细胞核的染色体可分为常染色体和性染色体。在男性和女性中，常染色体都是二倍体，每条染色体都有两个同源拷贝：一条（单倍体）来自母体，一条（单倍体）来自父体。

染色体的数量是针对物种的。性染色体具有性别特征。

在人类中，女性有两条X染色体，男性有一条X染色体和一条Y染色体。人类基因组中约有6109个核苷酸，重量约为6pg。只有大约2%的DNA重量为蛋白质编码，包括大约3104个基因，平均长度为3103个核苷酸。

在一个基因内，编码序列（外显子）被发现在非编码区（内含子）之间，还发现退化的基因，称为假基因。它们由于突变而失去了功能，但残存的序列图案仍然存在。

分子诊断关注核酸的具体特征，主要是确定序列的存在，这也是分子诊断的「核心概念」。

2001年，在许多科学家的共同努力下基因组的全部序列在《自然》杂志上发表，包括与各个染色体有关的序列。此后，许多个体的人类基因组被测序，从而获得了大量的知识，包括分子诊断的目标。

基因组的一小部分（大约3.5%）为蛋白质、核糖体RNA（rRNA）和转移RNA（tRNA）编码。

编码序列被称为基因，其转录物被称为信使RNA（mRNA）。除了组蛋白、防御素、tRNA和rRNA之外，每条染色体都含有一个基因拷贝（称为等位基因），基因组上等位基因所在的部位称为基因座。

所有DNA的绝大部分（96.5%）含有不编码蛋白质或结构性RNA分子的序列，其功能有时是已知的，某些DNA序列调节基因表达。这些调节序列可以与调节蛋白或激素-受体复合物相互作用，例如作为某种基因的启动子。

1.1、重复

许多序列在基因组中彼此相继出现数次或多次，或分散在各处。这些重复序列的确切功能目前还不清楚（还不知道），但可以肯定的是它们不是编码mRNA的。

重复序列是根据片段长度、序列和基因组位置来分类的。

在等温线梯度离心法中，重复序列有非常典型的沉淀行为。它们形成一条与其他DNA不同的带子，其特点是被称为卫星DNA。卫星DNA不是同质的，被进一步分为迷你和微型卫星，由（非常）短的（迷你，或1-6bp的「简单序列」重复）、较大的（10-100bp）、中等大小的（约300bp）和非常大的重复（>2kbp）组成。

简单序列重复（SSR）或微型卫星经常被用于分子诊断中。最简单的由一个（mono; -An-）、两个（di; -CAn-）、三个（tri）或四个（tetra）核苷酸组成，可以重复10~100次。

当十次以上的重复是串联的，其数量经常变化。这种变异是等位基因特异性和遗传性的。

当个体之间的SSR出现很多变异时，该序列被称为超变异性。

单重复和双重复被用作分子病理学和植物健康调查的诊断工具，而三重复被用于临床遗传学和植物健康调查,四重复序列（也称为STRs的短四核苷酸重复序列）用于法医学、植物健康调查和病理学。

重复序列的其他例子是多T段、卫星DNA或中心粒（ACAAACT/ATAAACT/ACAAATT）n和端粒（TTAGGG）n。在基因组的许多不同位置都有高达约300bp的重复序列。

重复序列对许多生物的系统发育分析也很重要，可用于绘制未知序列。

一些重复序列有复数序列,在DNA链的两个方向上有相同的序列。根据其序列组成的不同，复数序列可以出现数次至数百万次。

细菌内切酶（限制性酶）可以识别和消化（「切割」）某些复数序列,这些位点被称为限制性或RE位点（代表限制性内切酶）。

宫锁链序列可以在分离的DNA中产生倒置的重复结构，也可以在单链DNA或RNA中形成发夹结构。有些只存在于某些类别的细菌和病毒的基因组中。

例如，在大肠杆菌、沙门氏菌和其他肠杆菌科中发现的肠杆菌重复基因间共识（ERIC）序列是不完全的宫廷体，在整个基因组中穿插存在。在不同类型的细菌物种之间，发现了如此不同的数字，可以做出指纹。

同样类型的细菌重复是BOX元素，如肺炎链球菌。

小卫星的可变串联重复数（VNTRs）是10-60个核苷酸的重复，分布在整个基因组中的1000多个位点上，VNTRs通常富含G-C，显示出个体差异。

「短穿插元素」（SINEs）是高达500bp的重复，可在分布于基因组的特定部位发现。Alu重复是一种在灵长类动物中发现的300bp的物种特异性重复，已被观察到超过100万次（占人类DNA的10.6%）。

该重复含有可被Alu限制性内切酶特异性切割的回文序列，因此得名。各种疾病都与偏离或突变的Alu重复模式有关。

「长穿插元素」（LINEs）大小为9000bp，约占人类基因组的17%。在超过8105个LINEs中，大约有50个具有转录或翻译活性。人类之间LINEs的位置和数量各不相同。

1.2、其他DNA片段

其他DNA片段是假基因、基因片段和大量的独特间隔物。假基因会导至假阳性的基因表达信号。

SNP表示基因组上某一位置的核苷酸序列的遗传差异，在一般人群中存在超过1%。SNP发生在整个基因组中，可以在编码和非编码序列中发现，大约每100~300bp发生一次。

SNPs在几乎80%的情况下由单个碱基的替换组成：C变成T（出现频率最高）、C变成G或A变成G，如果一个SNP位于一个基因中，其结果是氨基酸序列可能发生变化。

然而，这取决于它在三联体代码中的位置。如果SNP导至一个不同的氨基酸的加入，该SNP被称为非同义词。这主要发生在SNP位于三联体密码的第一个碱基上，有时位于第二个碱基上。

当一个SNP不导至不同氨基酸的结合时，它被定义为同义。这主要发生在SNP位于三联密码子的第三个碱基上。

目前，在人类基因组中已经发现了超过4106个SNPs。一个平均20kb的基因包含大约40个SNPs，其中一些与疾病有关。某些SNPs和遗传疾病之间的相关性越来越受到关注。这尤其适用于代谢性疾病和对某些药物治疗的反应。

至少有200个碱基且GC含量超过50%的区域被称为CpG位点或CpG岛。

术语CpG表示带有「-C-phosphate-G 」的线性序列，目的是将其与C:G碱基配对区分开来。

哺乳动物基因组中的许多基因在其启动子区域都有这些CpG岛，大约70~80%的CpG位点在嘧啶的C5位上被甲基化。

碱基的甲基化改变了DNA的结构，使DNA无法翻译，因此基因表达受到影响。

在成熟的体细胞中，DNA甲基化主要发生在CpG位点，但在胚胎干细胞中并非如此。某些基因的甲基化也与某些疾病有关。甲基化可以通过对样品的特殊预处理来检测。

基因组的致病畸变是分子诊断的一个重要目标。

有许多技术可以检测这些畸变，例如通过核型的变化、非功能蛋白的产生、肿瘤抑制的丧失、易位、基因拷贝数的丢失或变化或点突变。

遗传缺陷通过配子从父母那里传给孩子。在受孕的那一刻，已经确定孩子是在两条染色体上都有突变（同源突变体）还是只得到一条有畸变的染色体（杂合突变体）。

有几个突变是熟悉的，如乳腺癌的BRCA基因或脆弱的X染色体。其他突变是在生殖细胞或子宫的形成过程中随机发生的，例如21号染色体有3个拷贝的唐氏综合症。

由于这种突变起源于受孕前，因此可以认为是一种先天性突变，对于有先天性突变的人的后代，这种突变被认为是一种遗传缺陷。

突变也可以在生物体的一生中偶然发生。这些突变被称为体细胞突变。体细胞突变最著名的例子是恶性肿瘤细胞，一个异常的细胞在正常细胞之间成长为威胁生命的恶性肿瘤。

恶性肿瘤中可能存在许多突变，如染色体数目、基因拷贝、染色体之间的交换（易位）、致癌基因的内窥镜（串联重复）或某些染色体或部分染色体的更多拷贝的非整倍体DNA内容，可能与其他染色体的丢失相结合的怪异缺陷，体细胞突变的特点是表达模式紊乱（病理）。

如果与健康捐赠者相比，癌症患者往往显示出血浆DNA水平的增加。这种由肿瘤细胞坏死和凋亡产生的额外的DNA，在许多情况下被证明是有用的生物标志物，不仅是一种诊断工具，也是治疗和预后的指标。

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