| 在分子诊断产品开发过程中，离不开核酸浓度测定步骤，如引物探针筛选时的用量、试剂检出限和定量限确定时的靶标浓度，只有在前期步骤中明确核酸含量，后期的转产工艺才能更加可控、产品性能也才有保障。而核酸浓度的测定方法多种多样，根据核酸类型和用途，选择合适的方法测定浓度，才能达到事半功倍的效果。
分光光度法是基于物质的光吸收特性来测定浓度的。核酸包含脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），是一种核苷酸聚合物，其核苷酸单体由戊糖、磷酸基和含氮碱基组成。其中，戊糖和磷酸可通过反应形成具有光吸收特性的产物，对此建立的分光光度法有定糖法和定磷法；而碱基本身便具有光吸收特性，可直接采用紫外分光光度法进行定量。(1)原理：核酸中的戊糖（核糖或脱氧核糖）在浓盐酸或浓硫酸作用下可脱水生成醛类化合物，该化合物进一步与某些成色剂反应形成有色化合物，在特定波长下具有相应吸收值，且在一定浓度范围内，溶液的吸收值与核酸浓度成正比，借此可对核酸进行定量。①RNA浓度测定：RNA与浓盐酸在共热时，RNA中的核糖可转变为糠醛，并与3，5-二羟基甲苯（地衣酚）在三氯化铁催化下，反应生成鲜绿色化合物，该产物在670nm处具有最大吸收值。该方法测定的RNA浓度在20~200ng/μL范围内，浓度与光吸收值成正比。②DNA浓度测定：DNA的α-脱氧核糖在酸性条件下可转变为ω-羟基-γ-酮基戊醛，其与二苯胺共热后可生成蓝色化合物，该产物在595nm处具有最大吸收值。该方法测定的DNA浓度在50~400ng/μL范围内，浓度与吸光值成正比。(2)特点：该方法特异性较差，凡戊糖皆可反应，其他糖类及其衍生物、醛类和蛋白质等会干扰实验结果，操作过程较为繁琐，如今已较少采用。 核酸是一类含磷化合物，磷酸基比例相对固定，其中RNA含磷量约为9.0%、DNA含磷量约为9.2%，因此通过定磷法确定磷含量后，便可推算出样品中的核酸含量。(1)原理：核酸分子的有机磷在强酸条件下被消化为无机磷，进而与钼酸铵结合成黄色的磷钼酸铵络合物，该络合物在还原剂作用下立即转变为蓝色的钼蓝，在650~660nm波长处具有最大吸收值。在一定范围内，根据吸光值与磷含量的正比关系确定无机磷浓度，进而确定核酸浓度。该方法测定的核酸浓度范围一般为10~100ng/μL。(2)特点：该方法测定的是样品中的总磷量，若样品中含有无机磷杂质，需通过对照组扣除无机磷含量，该方法灵敏度相对较高，但易受蛋白质和核苷酸影响。核酸分子上的碱基含有芳香环结构，具有紫外吸收特性，在250~280nm波长范围内具有强烈的光吸收能力，其中最大吸收波长位于260nm处。(1)原理：根据核酸在260nm波长处的光吸收特性，结合朗伯比尔定律，对核酸浓度进行确定。其中ThermoFisher的NanoDrop是当前较为常用的分光光度计，其测定样品浓度的数学公式为：研究者根据测试确定了不同核酸类型的系数f，其中dsDNA系数为50ng·cm/μL、ssDNA系数为33ng·cm/μL、RNA系数为40ng·cm/μL。将光程b归一化为1cm后，则吸光值A为1时，相当于dsDNA浓度约为50ng/μL、或ssDNA浓度约为33ng/μL、或RNA浓度约为40ng/μL。由此，可根据吸光度估算核酸的浓度，这种计算在许多仪器中可自动进行。①操作简单，无样品制备、添加染料或标准品等操作，上样体积较少，1~2μL即可。②灵敏度有限，以NanoDrop上的基座进行检测时，dsDNA的检测下限为2ng/μL、ssDNA的检测下限为1.3ng/μL、RNA的检测下限为1.6ng/μL，且无法区分DNA和RNA，当样品中包含其他核酸或游离核苷酸时，测得的总核酸量偏高。④仪器测得的数据中包含A260/A280和A260/A230比值，可初步评估核酸样品纯度，纯DNA的A260/A280约为1.8、纯RNA的A260/A280约为2.0，纯 DNA和RNA的A260/A230通常为1.8~2.2。(1)原理：利用荧光染料与核酸分子结合后，在特定波长光源激发下发出荧光，再根据荧光强度的高低对核酸浓度进行定量。该方法针对DNA和RNA有对应的特异性结合荧光染料，可对dsDNA、ssDNA和RNA进行区分检测。其检测过程需使用酶标仪或荧光计，以ThermoFisher的Qubit为例，测试过程中，需先使用标准品生成标准曲线，再对样本进行定量。大致过程为：将标准品和样本分别与检测工作液在专用反应管中混合后，室温孵育2min，再置于荧光计上读取数据。①定量过程需要制作标准曲线，操作过程相对繁琐，样本定量浓度的准确性受标准品影响，不在定量范围内的过高或过低浓度样本，均无法定量。②荧光检测过程对环境因素较为敏感，易受温度、光度等干扰，同时需使用专用的耗材和试剂。③相比NanoDrop，灵敏度和特异性均提高，可检测到pg级别。其中高敏dsDNA定量范围为10pg/μL~100ng/μL、ssDNA定量范围为50pg/μL~200ng/μL、RNA定量范围为250pg/μL~100 ng/μL；通过染料特异性结合，对dsDNA、ssDNA和RNA进行选择性区分测量，准确检测靶核酸分子浓度。从Qubit与NanoDrop的对比数据看，NanoDrop测量低浓度样本时，浓度偏差较大；在含有DNA和RNA的样品中，NanoDrop仅能测到总核酸量，而Qubit则可选择性区分定量DNA和RNA。(1)原理：通过在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针，使得核酸扩增过程呈现出实时的荧光信号变化，且其扩增指数期对应的Ct值与起始模板浓度的对数存在线性反比关系，由此，结合已知浓度标准品建立的标准曲线，可对核酸进行定量。该方法是基于特异性的引物和探针来检测的，可用于确定靶核酸的拷贝数。①qPCR可用染料法或探针法，探针法还可使用多重检测。②特异性和灵敏度均较高，引物和探针的特异性确保只对靶核酸准确定量，不受非目标核酸和其他游离核苷酸的影响；通过扩增的方法对核酸进行定量，使得检测灵敏度可低至fg级别。③需要特定试剂和仪器，操作过程繁琐、检测时间较长，依靠标准品确定样品浓度，只有当标准品与待测样品具有相同扩增效率时，其定量浓度才准确可靠。(1)原理：数字PCR（dPCR）是一种不依赖Ct值、无需标准曲线的绝对定量方法，该方法将标准的PCR反应体系分隔在许多微小的反应单元中，并通过有限稀释使得靶核酸分子在反应单元中的数量平均为1个或0个，对应反应单元的检测信号为“有”或“无”，由此可直接计算靶核酸的数量。而在实际测试时，一个有信号的反应单元可能包含1个以上的靶核酸，因此需结合泊松分布原理进行统计，确定靶核酸拷贝数。①dPCR是基于qPCR检测方法的绝对定量手段，其定量过程采用终点法判读信号的“有”或“无”，无需要通过标准品，则可直接对样品进行定量。②抗干扰能力较强，不受PCR扩增效率影响，具有更高灵敏度和准确度，可达到单拷贝定量水平。③在进行dPCR定量之前，需确定样本的大致浓度，避免因样本浓度过高或过低导至统计学公式计算偏差，使得检测结果不准确。随着技术的发展，核酸定量方法也在更新升级，终归来讲，新技术的检测结果将越来越准确，但在实际使用中，应综合考虑各种因素（如检测成本、便捷性、定量目的等），选择合适的方法即可。比如，对于合成纯化后的引物探针，采用NanoDrop测定浓度即可；而在高通量测序文库构建中，则需采用Qubit或qPCR对文库浓度进行定量；在确定分子诊断产品的检测限或定量限时，则可采用dPCR定量原始样本浓度。或者，在选择方法时，我们也可以根据待测核酸类型，结合各种方法的检测范围，选择合适的定量过程。如提取后纯度和含量均较高的质粒或人基因组，我们通过NanoDrop则可大致确定其浓度；而对于浓度较低且易受背景核酸干扰的病毒基因组，则需采用特异的方法如qPCR或dPCR进行定量。另外，在实际应用中，核酸的不同定量方法也可以是相辅相成的。Qubit或qPCR的定量结果，可作为dPCR检测样品的参考稀释范围；dPCR的检测结果，可能可作为qPCR的标准浓度。
参考资料 [1] ThermoFisher官网 [2]Quan P L, Martin S, Eric B. DPCR: A technology review[J]. Sensors, 2018, 18(4). 若涉及侵权，请联系删除.
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