分子技术丨Fluidigm芯片平台

美国Fluidigm公司（www.fluidigm.com）创立于1999年，总部设在美国加州。

1998年加州理工大学的Stephen Quake教授发明了核心技术——微流控阀门（Valve），随后，Stephen Quake（首席顾问） 和 Gajus Worthington（公司CEO） 在1999年成立了Fluidigm公司，Fluidigm公司最核心的技术就是它的微流控阀门技术，这个阀门的材料是一种软胶状的材料，它受电信号的控制，可以打开，或者关闭微流路，这样就起到了控制微小液流的效果。Fluidigm进行用于生物技术研究的微流控芯片及硬件的开发和销售，技术支持。

Fluidigm高通量基因分析系统（Biomark^TM和EP1^TM）自上市以来得到了全球各个研究领域科学家的认可和赞誉，2014年，它又推出了全新的SNP基因分型平台——Juno^TM系统，它能在不到3小时的时间内处理并完成低至2.5ng/ul的DNA样本的SNP基因分型。

Biomark™ HD系统 

Biomark™ HD系统：本质上是一个基于微流控的、高通量的实时定量PCR系统；是集成流体通路（Integrated Fluidic Circuit，IFC）技术、实时定量PCR技术及强大的基因分析软件相结合的技术平台。

核心技术：Biomark™ HD系统的核心技术就在于将实时定量技术集成了流体通路技术：利用集成电路制作工艺（光刻）在硅片或石英玻璃上刻上许多微管和微腔体做成阵列芯片，并通过独立的纳米级微型阀门控制溶液在阵列反应仓（Reaction Chamber）中的流动来实现生物样品的分液、qPCR体系混合建立，并实现高效准确地实时PCR扩增、检测。

系统组成：Biomark™ HD基因分析系统由Bio-Mark™实时PCR系统（整合了高性能计算机）、IFC微液流芯片（耗材）、IFC Controller（或者称Loader，将生物样品、反应试剂导入到IFC微液流芯片中）和数据分析软件四部分构成。

核心部件1：BioMark主机是一个同时拥有热循环功能和拍照成像功能的仪器。它每走一个Cycle，就对IFC拍一张照片，也就是说，它是一台实时荧光定量PCR仪，不同的是，BioMark这个主机，它加热的是Fluidigm的芯片，而qPCR仪上加热的一般是96/384板。

核心部件2：Biomark™ HD系统的核心部件就是微流控芯片，此芯片有如下几种不同格式，满足不同SNP位点和样本数的研究需求，分别为Flex Six 12*12 IFC（12 Samples *12 SNPs），48*48 IFC（48 Samples *48 SNPs），96*96 IFC（96 Samples *96 SNPs），192*24 IFC（192 Samples *24 SNPs），其中Flex Six 12*12 IFC有6个不同的分区，这6个不同的分区可以单独或同时运行，组合比较灵活，同时也可以自己跟Fluidigm公司定制芯片，比如国内某公司定制的24*192 IFC（24 Samples *192 SNPs），不同格式检测芯片如下图：

注释：rxns=reactions，就是把reaction缩写为rxn 20rxns，就是能做20反应

此芯片由三部分组成，以48*48（48 Samples *48 SNPs）IFC为例来介绍：

芯片左侧，是一组48小孔，每个小孔当中可以放一种等位基因qPCR的ASP Master Mix，也就是Assay反应液。

芯片右侧，也是一组48小孔，每个小孔当中可以放一个样本溶液，也就是Sample预扩增稀释样本。

芯片中央部分，是阵列反应仓（reaction chamber），微流路把Assay溶液和样本溶液引入到每个chamber小孔中，在这个微流路上，设置了一系列的阀门，这些阀门，可以保证Assay反应液和样本溶液分别进入相对应的反应仓，然后进行qPCR反应。

核心部件3：操作过程中，需先用移液器，把Assay反应液和样本溶液加入到小孔当中；接着，IFC Controller通过微流控的阀门控制，将生物样品、反应试剂导入到IFC微液流芯片中的每个chamber小孔中，然后，把这张芯片放到BioMark的热循环仪上，进行实时定量PCR反应。

EP1™ 系统 

EP1™ 系统：EP1™系统跟Biomark™ HD系统类似，不多做赘述，EP1™高通量基因分析系统由EP1™ Reader PCR仪、IFC微液流芯片（耗材）、IFC Controller（将生物样品、反应试剂导入到IFC微液流芯片中）和基因分析软件四部分构成。

Juno^TM系统 

Juno^TM系统：Fluidigm公司于2014年下半年推出了Juno机器，Juno系统第一次使用了一种微流控芯片技术，它在一块芯片上整合了加样、预扩增和PCR基因分型，做完PCR基因分型之后，用终点荧光法来进行扫描。可以用BioMark机器进行扫描，也可以用EP1机器进行扫描。其中，EP1机器是一个终点法的扫描仪，没有热循环功能。

Juno系统为了解决传统SNP基因分型实验的限制，新的芯片只需要5.5ng的DNA，浓度为2.5ng/ul。Juno平台在降低使用开放型的微量滴定板做多步骤的实验流程中存在的错误和PCR污染的风险的同时，大大缩短数据采集的时间。

虽然市场上的其他解决方案需要多次动手步骤并且从样本到数据的时间至少是5小时，但是一步法的，全自动的Juno系统的工作流程只需要15分钟准备试剂，在不到3小时的时间内就能拿到数据。

Juno平台的灵活性和易用性将使核心实验室可以简单地满足许多不同客户的需求，并且系统在一块芯片上整合预扩增和基因分型的能力将使临床实验室能经济地从低浓度DNA样本中获得快速和准确的结果。

Fluidigm的每个反应Chamber，它的体积是非常小的，以96*96的芯片为例，每个chamber的反应体积只有7个纳升的大小，也就是说，能够进入chamber的样本溶液体积是非常小的（对于本来目标基因拷贝数比较稀的样本，需要做预扩增，样本在上机之前，先要用扩增引物进行一次扩增，扩增好了之后，把样本加到芯片的样本孔当中，进行反应。这样才能保证每个chamber当中，都有足够多的原始目标基因片段供扩增之用）。

BioMark/EP1/Juno仪器检测只能检测两种荧光：分别是橙红色和绿色。其中橙红色是用来检测ROX内参荧光素的荧光强度；绿色荧光通道，是留给样本用的。

所以，要测SNP的时候，可以设计两个绿色荧光的TaqMan探针，分别针对野生型和突变型做2个Assay，分别反应。这与常规的用Taqman法测SNP时候，一个孔里同时测到红、绿两色荧光，一个孔就可以得到野生型和突变型的等位基因频率，是不一样的。在BioMark上测SNP，是要分别做2个独立的反应的。

Fluidigm基于荧光标记单碱基延伸原理的分型技术，只能检测HEX和FARM两种荧光信号，所以此平台最多只能做2个Allele的分型分析，超过2个的Allele则不能使用此技术分型，除非舍去最低频率的Allele。

当我们做一个项目时，以48*48为例（做96*96则不需要提前预扩增，可直接上juno系统，在一块芯片上进行加样、预扩增和PCR基因分型）：

1.首先确认SNP位点；

2.查找SNP位点序列；

3.利用引物软件设计SNP的引物（一个SNP对应4条引物，一对扩增引物，一条针对野生型的引物ASP1，一条针对突变型的引物ASP2，ASP均经过修饰）；

4.引物进行稀释成100uM，扩增引物混合成一管PCR Mix，Assay引物按SNP的两种基因型Mix进行混合；

5.在普通PCR仪器上进行96孔板的样本预扩增，每个样本均单独用PCR Mix进行扩增；

6.将预扩增样本进行稀释，然后转移到ICF的右侧Sample区域，将每个SNP的两种基因型Mix分装到左侧的Assay区域；

7.上juno机器进行Assay分型；

8.采用EP1的终点扫描法仪器扫描，设定每个SNP两种Allele的荧光信号，比如A为HEX，G为FARM，然后进行cluster聚类分析；

9.数据下机。

下机数据经过分析之后变成excel表的格式：

第一列为Chamber信息，可以不用管；

第二列为检测的SNP信息；

第三列为检测的SNP对应的一个Allele，命名为Allele X（对应检测的FAM荧光）；

第四列为检测的SNP对应的另一个Allele，命名为Allele Y（对应检测的HEX荧光）；

第五列为检测样本的名称信息；

第六列为检测结果的ROX值，起到校准信息的作用；

第七列为检测的SNPtype-FAM : SNPtype-HEX值，比如XX、XY、YY，则对应相应的SNP基因型；

第八列为检测的Confidence值，值越高检测结果准确性越高，一般置信度＞65%，则call rate可信；

第九列为最终的检测结果，这跟第七列比较像，但是是Final的结果，也就是第七列的结果在进行cluster分析的时候人为修改之后的最终结果，比如上图中的第71行第7列和第9列，机器识别为XY，人为修改之后变为XX，这是机器本身分型的局限，所以有时候数据也需要结合人工来进行修正，这也是最终的结果（理论上这种点应该用一代验证）；

第十列为第九列检测出的值进行Converted的基因型，比如XX为AA，XY为AG，YY为GG，至于未检测出来的则为No Call，或者检测出来但是为invalid（无效的），这些都需要换用其它方法进行重新检测；

第十一列为检测的Allele X的Intensity；

第十二列为检测的Allele Y的Intensity；第11列和第12列的结果应该综合起来看，这X/Y为坐标轴对应的X轴和Y轴的值，也就是SNP位点的坐标位置，这个最主要的作用就是可以供数据分析者辅助重新分析数据出来的不确定结果；

第十三列为User进行注释使用的。

所以拿到数据之后一般看第二列的SNP信息、第八列的置信区间和第十列的检测结果就ok了，然后进行后面的注释和分析，至于未出来的或者不可信的或者无效的结果，那该换其他方法补测的那就换其它方法补测。

用Fluidigm来做qPCR，它最大的好处，是可以节省大量的人工、反应试剂、和实验时间。

反应体积从常规PCR的20个微升（每反应），降低到了几个纳升。所以，能够大量地节省试剂。

人工上，主要是省在配制反应的时间上。例如，原来要对96个样本做96个基因表达量的检测，那么，就要配96*96个反应。一共是9,216个反应，那么每个反应，都至少要加入Master Mix，又要加入样本，那么，就一共要进行18,432次加液。那现在用Fluidigm的芯片，人工加液的步骤，只要加96个样本、再加96个Master Mix。一共只要加液192次。后面，把样本溶液与master mix溶液交叉注入反应小室的工作，是由加样机（Loader）给（自动）完成的。

常见平台的数据对比

*检出率（Call Rate）：对于SNP研究而言，检出率（Call Rate）是一个相当重要的指标，例如在一个样本上同时检测48个SNP位点，检测率为98.8%的方法，其检测的成功率是：98.8×98.8×98.8×…98.8=0.560=56%，而检出率是99.5％的方法，其检测的成功率则是：99.5×99.5×99.5×…×99.5=0.786=78.6％，可以看出检出率对检测的成功率的影响是显而易见的，同时检测的SNP位点数越多，影响越大。

1. http://cn.fluidigm.com/products/biomark-hd-system

2. http://cn.fluidigm.com/products/juno

3. http://cn.fluidigm.com/products/ep1-system

4. http://cn.fluidigm.com/products/access-array

5. http://cn.fluidigm.com/ifcs