诊断技术｜引物的设计-定量限、检测限和结语

确定引物组的效率还可以使用线性回归分析来评估检测的线性范围，也就是Cqs与浓度成正比的目标浓度范围。

这对定量来说是至关重要的，只有落在实际检测极限范围内的样品才应该被定量，尽管它们当然可以被报告为“检测”。

定量限（LoQ）是指报告预定变异性的最低拷贝数，通常记录为变异系数（CV），尽管我们觉得对qPCR来说，用倍差来衡量，可能是两到三倍，会更合适。

LoQ总是高于检测限（LoD），检测限是指可以可靠地检测到的最低目标拷贝数。

理论上，检测限是1，因为即使是目标DNA的一个拷贝也可以通过PCR扩增并产生高于荧光噪声的信号。

然而，在非常低的分析物浓度下，溶液的组成并不均匀。采样误差（泊松误差）决定了可以检测到的最低浓度的目标DNA。

在实践中，10个拷贝的目标DNA可能是每次使用优化的qPCR能够可靠地扩增的最低浓度。

一个典型的例子是标准曲线和一系列未知浓度的样品计算出的拷贝数，这些样品落在其线性范围内，因此理论上可以被量化，如图10所示。

图10 | 对未知拷贝数的样品进行定量，使用标准曲线，F引物GTTTGGTTGAGCAATACGAC和R引物CTACCTGATTTGAGGTCAAAGTTTG针对白色念珠菌18S rRNA基因，使用Agilent的Brilliant III SYBR Green mastermix（目录号600882）。

A、PCR参数。

B、由Bio-Rad公司的CFX qPCR仪器记录的Cqs、扩增图和标准曲线。

C、从B中的稀释曲线得出的拷贝数。还显示了与这些拷贝数相关的不确定性，根据95%的CI值计算，并以折差表示。统计分析是用Prism 8 for Mac进行的。

这些数据再次证实了这样一个概念，即一个实验中的固有变异性至少是2倍，如果运行几个重复的实验，变异性会更大。如果对同一样品的独立提取进行比较，这种变异性可能会高得多。在审查那些声称对较小的倍数变化有意义的出版物时，必须牢记这一点。

另一点要记住的是，虽然能够证明八个或更多数量级的线性可能看起来不错，但使用这样的标准曲线会掩盖真正的变异性，特别是当低拷贝数目标被量化时。

如果不绘制图10所示的标准曲线，而是分别绘制较低和较高的稀释液，并用于量化各自范围内的样品，就可以证明这一点。

图11 | LOD和LOQ的测定。

A、最高拷贝数标准品（1x108~1x103）的标准曲线。

B、最高拷贝数标准品（1x103-1）获得的曲线。

C、来自A的标准曲线，重新绘制了95%CI。

D、来自B的标准曲线用95%的CI重新绘制。

E、从A中的标准曲线得到的拷贝数。

F、从A中的标准曲线得到的拷贝数。

图11A、B显示了仪器绘制的标准曲线，PCR效率的单一数值分别为98.4%和130.3%。如果重新绘制数据以包括95%的置信区间（图11C，D），然后用来计算目标拷贝数（图11E，F）。

很明显，基于较高拷贝数的标准曲线得到的量化结果与基于图10所示标准曲线的数据相似，甚至更好。这是因为对于较低拷贝数的目标，由于效率和R2值较差（分别为98% vs 130%和0.999 vs 0.967），所以拷贝数和与之相关的不确定性都有很大不同。

显然，拷贝数低于3000左右的定量需要额外的优化，这在最简单的情况下涉及到更精确的稀释和移液。

图12 | 低拷贝数目标的LOQ的确定。

A、将用图10所述引物扩增白色念珠菌DNA得到的PCR扩增子移液到100纳克人类染色体DNA中，并进行连续5倍稀释，制备新鲜标准品。

B、重新绘制的带有95%CI的标准曲线。

C、从标准曲线得到的拷贝数，记录95%CI范围内的倍数差异。

图12显示了为高拷贝数目标优化的标准曲线，将DNA样品稀释成100 ng的染色体DNA并进行五倍稀释。现在效率（101%）和R2值（0.990）都与图11所示的高拷贝数标准曲线相当，记录较高Cq值的样品的倍数差现在约为2至3倍，即在loQ范围内。

符合要求、以及连贯的引物设计是任何旨在量化核酸的项目的核心。

每一个新的设计都必须在模拟研究中进行验证，排除具有可疑二级结构的引物，如发夹和引物减数器，以及可能降低扩增特异性和扩增子产量，即检测灵敏度的非特异性结合。

此外，重要的是避免引物结合区域内的SNP位点，这些位点可能会干扰引物的有效退火或完全阻止扩增。一旦引物组被设计出来，就需要通过实验验证其特异性，并对扩增子产量进行优化。

最后，应确定优化后的引物组合的线性度，这样可以确定检测的灵敏度和固有的变异性。最后，根据MIQE指南，在发表qPCR数据时应报告优化和验证过程的结果。