诊断技术｜引物的设计——引物的组合和浓度

寡核苷酸已经成为商品，其合成成本低廉，因此为每项检测评估多个正向和反向引物是可行的。我们建议每种引物有三个，从而形成九个引物组合。

图2 | 选择针对艰难梭菌tcdB基因的引物。

A、使用BeaconDesigner（PremierBiosoft）设计了三种正向引物（CD1、3和5）和三种反向引物（CD2、4和6）。

B、所有九种可能的引物组合被用来重复扩增从艰难梭菌630（CP010905.2）中提取的同一区域的染色体DNA，同时使用适当的NTCs。

C、使用Agilent的Brilliant III SYBR Green mastermix（目录号600882）进行扩增和溶解曲线条件。

D、使用CD1/2（绿色）和CD5/4（蓝色）进行扩增，分别记录了最低和最高的Cqs。只有一个NTC记录的Cq为45。

E、最敏感和最不敏感的引物组合之间的Cq范围是6.2。因此，首选引物对是CD1/CD2。CD5/4是最不理想的引物组合

图2显示了一个实验的结果，其中针对艰难梭菌tcdB基因（KC292190.1）的三种正向和三种反向引物进行了初步筛选，评估灵敏度（由量化周期（Cq）决定）和引物二聚体形成的潜力（由无模板对照（NTCs）的扩增决定）。

结果表明，引物序列的微小差异可以对检测的灵敏度产生重大影响，在这种情况下是70倍（高低Cq之差为6.19）。

尽管对于许多检测来说，引物的浓度可以有很大的变化而不会对PCR的性能产生明显的影响，但如果目标物的拷贝数较低或为了提高特异性，引物浓度的优化就很重要。

在测试了大量的检测方法后，我们观察到最差和最佳引物浓度之间的ΔCqs变化很大，大约5倍估计是一个工作平均值，尽管它可以大得多。

我们没有看到一个引物组不能被优化至少一点（2倍），但也看到有几个引物组的优化产生了巨大的差异，使灵敏度提高了100倍以上。

因此我们的建议是，作为验证任何新引物组的常规部分，值得进行这一额外的步骤，除非确定目标将以大量存在。

然而，尽管引物浓度的变化会对PCR结果产生重大影响，但引物浓度不可能是PCR实验可能成功或失败的主要原因。图3所示的结果证明了这一点，只要引物浓度保持在通常的200-400nM左右的范围内，灵敏度的差异就会小于4倍。

图 3 | 引物浓度对qPCR测定的影响。

A、使用Agilent的Brilliant III SYBR Green mastermix（目录号600882）和引物tcd-F: AGAGTTGGTAGAAAGGTGGAATTTAG和tcd-R.扩增和溶解曲线条件。ACATACCACCAATTTCTTTTAATGC针对艰难梭菌630（CP010905.2）的tcdB毒素基因（HM062503.1）。引物slpA-F：ATTAGTTATTATTTTGTTTTCTAAATTAT和slpA-R。CCTGTTTTTGCTGCAACTACT针对艰难梭菌s层蛋白的slpA基因（AB258978.1），用于扩增从艰难梭菌630（CP010905.2）提取的染色体DNA。

B、扩增图和溶解曲线。如果F或R引物的最终浓度保持在100nM，则得到绿色图谱，表明至少对于该引物组来说，100nM太低了。

C、Cq与引物浓度的关系图，表明200和400nM的最终引物浓度之间的差别很小。

将引物浓度降低到100nM以下是不可取的，如图4a所示，其中一个引物的最终浓度为50nM，导至检测的灵敏度明显降低。

图4 | 引物浓度对qPCR检测的明显影响。引物slpA-F和slpA-R针对艰难梭菌s层蛋白的slpA基因（AB258978.1），用于扩增从艰难梭菌630（CP010905.2）中提取的染色体DNA。

A、使用Agilent的Brilliant III SYBR Green mastermix（目录号600882）进行扩增和溶解曲线条件。

B、使用1 103个目标拷贝得到的扩增图和溶解曲线（插图）。三个蓝色的扩增图是在最终浓度为50nM F引物的情况下得到的，绿色和棕色的图分别是在最终浓度为100和200nM F引物的情况下得到的。

C、使用1 108个目标拷贝得到的扩增图和溶解曲线（插图）。

D、不同目标浓度之间的ΔCqs，用不同浓度的引物进行扩增

有趣的是，与图3中的例子相比，对于这个引物组，100 nM的最终浓度并没有导至灵敏度的大幅下降。

这些结果也表明，选择太低的引物浓度会影响检测的线性。

图4b显示了当使用1 105倍的模板时，使用相同引物浓度得到的结果。

除了50nM的引物浓度，对于其他所有引物浓度，两个实验条件之间的预期ΔCq为13.3，其中的差异要高得多（图4d）。

同样，结论是结果在很大程度上取决于引物，如果目的是将敏感性与准确的定量相结合，那么仔细优化引物浓度将变得很重要。