IVD工具人课堂 第四期 - 彩色微球层析产品开发介绍

彩色微球层析产品开发介绍

彩色微球介绍

彩色微球是以白色聚苯乙烯微球为基础，将彩色染料镶嵌在微球内部，微球表面修饰羧基、氨基或醛基等功能团的一类用于侧向免疫层析的纳米级微球。

彩色微球的染料是镶嵌在微球内部，微球表面无染料泄露，保证了微球的色彩鲜艳与稳定。微球颜色的选择主要以红、蓝颜色为主，现在很多厂家都推出了彩虹系列颜色供大家选用，还可以对下游的需求进行定制颜色，不过综合产品灵敏度和判读习惯，市场上的彩色微球产品主要还是选择了红、蓝颜色两种颜色。

微球表面修饰的功能团通过共价键偶联标记抗原或者抗体，比胶体金的吸附标记更加牢固稳定，可提高产品的检测灵敏度。

彩色微球的叫法很多，乳胶、胶乳、彩色乳胶，不管是那个叫法，东西都是一样的，我们在此统一称它为彩色微球吧。

彩色微球历史

其实乳胶微球在免疫检测的使用的历史比胶体金要早很多，在上个世纪60年代，Singer和 Plotz在检测人血清中类风湿因子项目中就用到了乳胶，随着技术的不断更新和后期对微球工艺的改进，现如今可以合成各类具有独特性能的微球，如彩色、荧光和磁性等胶乳微球。

苯乙烯单体在引发剂的作用下发生聚合反应，形成聚苯乙烯，使用不同的引发剂或者不同的单体衍生物及修饰体，可以得到带有不同功能团的微球。

前几年也有物理吸附的微球，但带功能团的化学偶联微球不管是在灵敏度还是稳定性都更佳，所以现在物理吸附的微球越来越少。

现在的微球厂家都可以提供根据客户对微球的功能团种类、含量和颜色进行定制服务，且微球单批次产量大，不担心微球批间差问题。

彩色微球的粒径

彩色微球的粒径大小对产品的灵敏度和特异性都会带来很大的差异，在相同的显色强度下，大粒径的微球比小粒径用量更低，这将使得单根条产品的标记蛋白使用量也同步减少，降低试剂条的生产成本。

不过大粒径的微球对跑板背景和产品特异性都将带来挑战。如500nm的微球跑CN140或者HF135的NC膜是比较困难的，建议使用CN95和HF90的NC膜。

彩色微球的粒径一般在100-400nm之间，其中300nm和400nm最为常用，粒径大的颗粒有利于提高检测灵敏度，而粒径小的颗粒有利于改善梯度。

彩色微球与蛋白的偶联原理

对于带羧基功能团的彩色微球，

使用EDC(+NHS)激活彩色微球上的羧基，然后与抗体上的氨基进行偶联，形成酰胺键。

对于带氨基的彩色微球，

使用过量的戊二醛反应与微球上的氨基反应，然后去除过量的戊二醛，再与抗体上的氨基进行偶联。

对于带醛基的彩色微球，

微球的醛基与抗体的氨基反应，形成一个不稳定的C=N双键，然后再用氰基硼氢化钠（NaCNBH3）氧化形成稳定的C-N单键。

用于层析的彩色微球，大部分选用带羧基的微球，这是因为羧基微球可以满足大部分的抗原抗体标记需求，且标记工艺稳定成熟。

彩色微球的标记工艺

大致相近，这里以主流的羧基微球为例。

1，微球清洗：

使用缓冲液如MES或HEPES对微球进行清洗，微球的保存液可能会有一些物质对标记带了影响，所以需要使微球处在反应的体系中；

2，微球活化：

选择NHS和EDC（两步法）或者EDC（一步法）对微球进行活化，EDC的用量对产品的灵敏度影响很大，可以根据微球COA的羧基含量来换算EDC的理论用量，也可以走个梯度看看那个用量比较合适；

3，清洗去除残留的活化剂：

高速离心去除残留的活化剂，离心后去除上清加入缓冲液后需要超声分散微球，每一步离心后均需要对其进行超声分散；

4，微球偶联：

加入适量标记抗原/抗体，快速混匀，反应数小时，有些选择37℃反应一两个小时，也有常温反应过夜；

5，封闭：

选择合适的封闭剂，如BSA、Casein对微球进行封闭数小时，有些工艺会使用乙醇胺对微球进行终止反应；

6，保存：

去除封闭后未结合的蛋白，加入保存液重悬微球，即为标记好的抗体-微球标记复合物。

彩色微球的特点

相比胶体金，彩色微球有很多胶体金不具有的特点，

首先彩色微球标记蛋白是以化学键结合，比胶体金的静电引力和疏水作用结合更佳牢固稳定；

其次胶体金标记过程不管是使用1/万的金还是4/万的金，都需要大体积标记好再浓缩使用，对标记设备如离心机要求高，而彩色微球标记过程使用高浓度微球含量标记，标记后稀释到适当浓度再使用，标记容器用50ml离心管就行；

再次彩色微球的标记过程按照优化好的SOP操作就行，每次标记的批间差小，不像胶体金标记受到的影响因素多，这对于没有开发胶体金产品经验的刚入这行企业来说是一个比较便捷的路径；

对于联检产品，彩色微球可以选用不同的颜色对联检项目进行区分，便于用户识别，比如Flu A&B联检项目，可以用红色微球标记Flu A的标记抗体，用蓝色微球标记Flu B的标记抗体，这样用颜色就明显区分两个待检项目，而这一点胶体金产品是没法做到的。

当然也有它的不足之处，

胶体金溶液自己用氯金酸和柠檬酸钠就可以制备获得，而彩色微球需要采购，目前还以进口微球为主，增加了试剂条的生产成本；

其次微球标记一般需要更长的时间，短则五六个小时，长的可能需要过夜标记，而胶体金一般两三个小时就完成标记。

彩色微球会替代胶体金吗？

当然不会，不过会慢慢抢去一些市场，就比如今年新冠抗原检测产品，有很多厂家选择了彩色微球。有些胶体金项目，在更改胶体金微球大小、标记工艺和标记蛋白等还不能达到性能要求的话，不妨尝试一下彩色微球，或许就达到了目的。

作者介绍：

水木木，在外资企业进行层析产品开发工作多年，现在进入IVD上游原材料企业，任技术销售。有需要联系作者的，请添加微信。