诊断技术｜免疫测试的那些事-免疫测试的类型和选择

在生产出所选择的抗体后，必须选择最理想的免疫测试形式。免疫测试可以分为同质和异质两种形式。

同质免疫测试不需要将与分析物结合的抗体与游离分析物进行物理分离，其中一个例子是荧光偏振免疫测试（FPIA）。

异质免疫测试涉及分离游离分析物和抗体结合的分析物，其中一个例子是酶联免疫吸附试验（ELISA）。

免疫测试方法可以进一步细分为“免疫测试”和“竞争”免疫测试（图1）。免疫测试法需要使用两个特定的检测分子（通常是抗体），也被称为三明治测试法。

固定的抗体通过与分析物的一个表位结合来捕获分析物，然后第二个标记的抗体结合，由于标签而产生的信号量与样品中分析物的浓度成正比（图1）。

图1 | 免疫测试和竞争性免疫测试系统的示意图。图中还显示了每种检测形式的典型反应曲线的例子。

在竞争性试验中，标记的（“示踪剂”）抗原和游离的抗原（来自要分析的样品）竞争性地与固定化的抗体结合。样品中分析物的水平越高，可用于结合的标记抗原的数量就越少。因此，产生的信号与游离抗原的浓度成反比，如图1中的曲线所示。

免疫测试法通常用于检测分子，如蛋白质和病毒，因为这些实体有能力促进两个或多个抗体的结合。

竞争性免疫测试法通常用于检测小分子，如药物和毒素。竞争性免疫测试使用一个分析物特异性检测抗体和一个“示踪剂”分子，它是目标分析物的一个标记版本。示踪剂经常被标记为一种酶或荧光体，能够产生可检测的信号。

为了确定样品中存在的分析物的浓度，可以使用一些基本技术。每种技术都有其独特的特性，这使其适合于识别不同类型的分析物，从细菌到内源性蛋白质到病毒和毒素。还必须考虑要检测的分析物的性质（大小、结构，以及是细胞质、周质还是膜结合）。

有许多不同的免疫测试方法可以使用，这些方法将在下面的内容中概述。

2.1.1、直接免疫测试法

如图2所示，直接抗体免疫分析涉及将分析物被动地或主动地涂在固体表面上。将已知浓度的抗原标准品连续稀释并加入到平板中，然后在设定的时间和温度下孵化（例如4℃过夜，室温两小时或37℃一小时）。

对表面进行封闭和清洗，以消除非特异性结合，并去除任何未结合的分析物。加入抗原特异性标记的抗体，测量产生的信号。

图2 | 直接免疫分析法。(A) 应用样品分析物并与固体表面结合。在封闭和清洗步骤之后，（B）引入特异性检测抗体，产生信号。

2.1.2、间接免疫测试法

间接免疫测试法可用于检测样品中与特定抗原结合的抗体（图3）。首先将目标抗原涂在一个固体表面上。将适当稀释的血清样品涂抹在涂抹的抗原上，样品中存在的任何抗原特异性抗体将被结合。

清洗（例如用磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗3次），以去除任何未结合的抗体和任何非特异性抗体与抗原的相互作用。然后应用物种特异性的酶联抗体，加入酶的底物，酶将底物转化为彩色或荧光产物，并测量信号。

图3 | 间接免疫分析法。(A) 首先将感兴趣的分析物与固体表面（如微孔板的孔）结合，然后进行封闭和清洗步骤。(B) 将含有相关抗体的血清在适当的缓冲液中稀释。然后进行第二次清洗步骤，洗去非特异性结合的抗体。(C) 加入酶标记的物种特异性抗体以检测血清抗体。(D) 再次清洗平板，加入酶底物，产生并测量信号。

例如，间接免疫测试法已被用于检测人类免疫缺陷病毒（HIV）抗体的存在[24]。自1980年代以来，间接ELISA被用于检测抗HIV抗体。2015年，Jeong和Ahn使用DNA编码的金纳米粒子（GNPs）开发了一种现代版的间接免疫测试法，称为“反向间接”免疫测试法，以检测多种病毒分析物。

他们的系统被称为“金纳米粒子增强的寡核苷酸连接的免疫吸附试验”（GNP-OLISA）。DNA链围绕着GNP并与HIV、丙型肝炎病毒（HCV）和乙型肝炎病毒（HBV）的抗原结合，产生Ag-GNP-DNA颗粒。

将加标记的人血清样本（含有针对HIV、HCV和HBV的抗体）加入到多重检测中。同时，在96孔板上涂上抗人类IgG，将样本加入孔中进行捕获。

使用了三种不同的RNA荧光探针，由RNAse H裂解产生的荧光信号与相应病毒的抗体量成线性比例。为了提高筛查效率和检测灵敏度，还加入了纳米颗粒。

2.1.3 夹心免疫测试法

三明治免疫分析的关键原理是使用一个捕捉抗原的抗体，然后再加入一个与单独表位结合的检测抗体。

为了进行有效的测量，抗原必须足够大，以包含两个抗原位点（表位），每个抗体都能充分无阻地进入，它允许对样品分析物进行检测和定量（图4）。

对于定量，必须包括由已知浓度的待测分析物的标准品组成的标准曲线。应包括至少8个分析物的稀释范围和一个阴性对照，每次测试应一式三份。

图4 夹心免疫分析法。(A) 应用捕获抗体并与固体表面结合。对表面进行封闭和清洗，以去除任何非特异性结合的抗体并防止非特异性结合。(B) 应用样品分析物并进行孵化，然后进行第二次清洗。(C) 引入一个酶标记的特异性检测抗体，并加入底物，产生可测量的信号。

夹心免疫测试的基本步骤包括：首先是分析物特异性抗体的表面固定化，然后是封闭和清洗步骤。在适当的时间内使用样品分析物，并使用酶联检测抗体进行检测。如果样品分析物存在，检测抗体结合，酶底物被引入，产生并测量信号。

竞争性免疫测试法通常用于测量小分子的存在和浓度，如药物、激素和毒素。它们只需要使用一个特定的抗体。这是有益的，因为小分子没有足够的表位来促进一个以上的检测抗体的结合。

竞争性检测需要一个“示踪剂”，它是由与信号生成酶、荧光体、纳米粒子或放射性标签相连接的有关分析物组成。竞争性测试在确定与其他抗原的交叉反应性方面是有效的。在竞争性免疫测试中，分析物与预先滴定的已知浓度的“示踪剂”进行竞争。

产生一个竞争曲线。样品中分析物的浓度越高，产生的信号越低。反之，分析物的浓度越低，产生的信号越高，因此产生的信号强度与分析物的浓度成反比。

竞争性免疫分析方法被用来测量一种叫做微囊藻毒素-LR的小分子（<1 kDa）的存在[30]。由于海藻毒素的尺寸很小，所以选择了竞争性免疫测试法，因为微囊藻毒素-LR只能促进一个特定的抗体与一个表位的结合。

图5 | 竞争性免疫测试法。(A) 将共轭小分子以最佳浓度涂抹在固体表面。检测表面被封闭和清洗以减少非特异性结合。(B) 将样品分析物（要检测的）和预先滴定的酶标记的抗体的混合物涂抹并孵化。游离的分析物（小分子）与表面结合的分析物竞争抗体的结合。之后是第二个洗涤步骤。(C) 未结合的抗体被洗掉。加入酶标记的底物，测量产生的信号并与存在的分析物浓度成反比。

图5概述了竞争性免疫分析的基本步骤。将预定的优化浓度的抗原涂在96孔板的表面上，用适当的封闭剂对板进行清洗和封闭。

将未知浓度的样品分析物和预定量的抗体混合在一起，孵化后加入到平板上。板子被孵化了一定的时间。清洗后，加入酶结合的第二抗体，在加入发色剂或荧光底物后，产生并测量信号。