备受期待的非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒名单终于公布了,我为大家准备了一些非瘟抗体ELISA知识点,能让大家在被口吐莲花的销售代表忽悠时保持一颗平常心。
一、非瘟病毒ELISA抗体检测盒的原理 33个非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒中有3种类型的ELISA,分别是间接ELISA(17个),阻断ELISA(12个)和夹心ELISA(4个)。依据的是国标《非洲猪瘟诊断技术》(GB/T18648-2020 )中的三种ELISA抗体检测方法。 1.间接ELISA 间接ELISA通常用于测定血清中IgG抗体,理论上也可以检测IgM抗体,但是IgM抗体通常使用捕获ELISA来检测。间接ELISA是应用最广泛的ELISA方法,由于只要获得抗原,配合通用的酶标抗猪IgG的二抗就可以快速建立ELISA方法。产品性能取决于抗原的纯度,抗原纯度不够会导至非特异IgG的结合,产生假阳性。 实验流程通常为: 1)准备好包被了已知定量的抗原的ELISA板。 2)加样:加待检测的样品。温育反应一定时间,如果血清中含有针对包被抗原的抗体,则待检抗体与固相抗原发生特异性结合,形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去未结合物质。 3)加酶标二抗:加入酶标抗抗体(二抗),该酶标二抗与抗原抗体复合物结合形成抗原—待测抗体—酶标二抗的复合物,温育,洗涤。 4)显色:加入底物溶液,温育一定时间后,固相上酶的催化底物产生有色产物,颜色深浅与抗体量成正比。 5)终止:加入终止液终止显色反应。 6)读数:使用酶标仪测定各孔光密度值(OD值)。 2.阻断ELISA/竞争ELISA 阻断ELISA/竞争ELISA通常用于测定血清中IgG抗体。阻断ELISA/竞争ELISA需要抗原和特异性的单抗或多抗。对抗原的纯度要求不高,产品的性能取决于单抗或多抗的特异性和亲和力。背景干扰低,特异性高。 实验流程通常为: 1)准备好包被了已知定量的抗原的ELISA板。 2)加样:加待检测的样品。温育反应一定时间,如果血清中含有针对包被抗原的抗体,则待检抗体与固相抗原发生特异性结合,形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去未结合物质。 3)加竞争抗体:加入酶标单抗或多抗,该酶标单抗或多抗与待测样品竞争性与包被抗原结合,形成抗原—酶标抗体的复合物,温育,洗涤。 4)显色:加入底物溶液,温育一定时间后,固相上酶的催化底物产生有色产物,待检抗体越多,颜色越浅;待检抗体越少,颜色越深。 5)终止:加入终止液终止显色反应。 6)读数:使用酶标仪测定各孔光密度值(OD值) 3.双抗原夹心ELISA 双抗原夹心ELISA用于测定血清中IgM、IgG、IgA等总抗体。技术难度最高,需要制备高质量的酶标抗原。该方法不受非特异性IgG的干扰,背景干扰小,敏感性和特异性高。 实验流程通常为: 1)准备好包被了已知定量的抗原的ELISA板。 2)加样:加待检测的样品。温育反应一定时间,如果血清中含有针对包被抗原的抗体,则待检抗体与固相抗原发生特异性结合,形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去未结合物质。 3)加酶标抗原:加入酶标抗原,该酶标抗原与抗原抗体复合物结合形成抗原—待测抗体—酶标抗原的复合物,温育,洗涤。 4)显色:加入底物溶液,温育一定时间后,固相上酶的催化底物产生有色产物,待测样品中抗体含量越高,颜色越深。 5)终止:加入终止液终止显色反应。 6)读数:使用酶标仪测定各孔光密度值(OD值)。
二、用于非洲猪瘟病毒抗体检测的常用蛋白 根据文献中报道具有诊断学意义的蛋白主要有P72(VP73)蛋白、P54蛋白、P30(P32)蛋白、PP62(P60)蛋白。 1.P72(VP73)蛋白 结构蛋白,由B646L基因编码,分子量约为73.09kDa。VP73在大多数毒株中相当稳定,能与所有感染猪的血清发生免疫学反应,且其抗原性非常稳定。该蛋白是血清学诊断方法的理想抗原,常被用于抗体检测。 2.P54蛋白 结构蛋白,由E183L基因编码,大小约25kDa。在病毒感染的早期阶段发挥作用,是病毒的复制必需蛋白。P54蛋白具有较好的免疫原性,其产生的抗体能够阻断病毒颗粒粘附到易感细胞上,该蛋白较为保守,产生的抗体在体内出现时间早,持续时间长。 3.P30(P32)蛋白 主要结构蛋白,由CP204L基因编码,在病毒感染的早期表达,可用于ASF感染早期诊断。 4.PP62(P60)蛋白 由CP530R基因编码,在病毒复制晚期表达,经过加工生成P35蛋白和P15蛋白。 用于 ASFV 抗体检测的抗原及其作用 可能会有很多人开始纠结于到底选择包被哪种蛋白的试剂盒,个人觉得对于ELISA试剂盒来说,蛋白选择固然重要,但是试剂盒的生产工艺对试剂性能的影响更大。 三、非洲猪瘟病毒抗体消长 根据Reis AL试验数据,E183L/p54, K205R, A104R/histone-like 和 B602L抗体反应强,14天IgG抗体100%转阳,持续39天以上。B646L/p73, CP204L/p32, CP312R, NP419L/DNA ligase 和F334L抗体反应中等,14天 IgG抗体未100%转阳,但可以检测到。K196R, K78R/p10和 C44L抗体较弱。。 ASFV12种蛋白的IgG抗体 E183L/ p54, K205R, A104R/histone-like 和 B602L四种蛋白的IgM抗体7天可以检测到,14天开始下降。 ASFV4种蛋白的IgM抗体 四、抗体检测的确诊方法 ELISA虽然简单易得,但是ELISA应用于筛查检测时仍然会出现假阳性和假阴性的结果。那么用什么方法去作为ELISA方法的确诊方法呢?(以某个品牌的所谓进口试剂盒去评价其他ELISA试剂盒的方法是错误的) 根据OIE陆生动物手册,可以使用间接免疫荧光(indirect fluorescent antibody,IFA)、间接免疫酶( indirect immunoperoxidase test ,IPT))和免疫印迹(immunoblotting ,IB)的方法作为ELISA实验的确诊方法。 (The most commonly used is the ELISA , which is suitable for examining serum or plasma. Confirmatory testing of ELISA-positive samples should be carried out using an alternative test, such as the IFAT, IPT or immunoblotting) 五、ELISA试剂盒的选择 市场上一下出现33个合法ELISA试剂盒究竟那个好呢,公告里也没告诉大家详细的比对数据,只能自己去选择了。 1.看研发实力 2.看试验数据 3.看临床应用 4.开展试剂盒评价 实验室应具备一定的试剂评价能力,评价方法见:诊断试剂评价系列3-血清检测方法。 六、不同使用场景下ELISA试剂盒的使用 1.鱼和熊掌不可兼得 世界上不存在敏感性和特异性都是100%的诊断试剂。ELISA试剂盒的敏感性和特异性就像一个跷跷板,每个厂家都会根据自己产品的定位找一个平衡点。或者要敏感性高一些牺牲特异性,或者要特异性高一些牺牲敏感性,或者取敏感性和特异性都不是最高,但是很均衡。 2.使用场景的选择 3.组合应用 对于发病场的筛查,需要先使用高敏感性的试剂进行初筛,阳性样品再用高特异性的试剂进行复核。 核酸检测和抗体检测也需要定期组合检测,保证猪群的双阴性。 一年来猪价起伏,养猪人实属不易。希望诊断试剂厂家能够真正为产业创造价值,为非瘟防控提供有效的工具。 [1]王功民,田克恭.非洲猪瘟[M].北京:中国农业出版社.2010年. [2]田克恭,李明.动物疫病诊断技术:理论与应用[M].北京:中国农业出版社.2014年. [3]AFRICAN SWINE FEVER:DETECTION AND DIAGNOSIS.FAO [4]AFRICAN SWINE FEVER.3.08.01.OIE [5]Reis AL, Parkhouse RME, Penedos AR, Martins C, Leitão A. Systematic analysis of longitudinal serological responses of pigs infected experimentally with African swine fever virus. J Gen Virol. 2007 Sep;88(Pt 9):2426-2434. |