ctDNA：来battle啊！

⑴ 液体活检：是利用人体体液（血液、尿液，胸腹水，脑脊液，唾液等）作为标本来源检测获取肿瘤相关信息的技术，它是一种简单且非侵入性的组织活检替代方法；

⑵ 液体活检有三宝：核酸，细胞和外囊泡，主要代表有ctDNA（循环肿瘤DNA），CTC（循环肿瘤细胞）和exosome（外泌体）；其中ctDNA和CTC是临床应用比较成熟且最受关注的两类液体活检靶标，其次是外泌体，目前临床应用成熟程度：ctDNA>CTC>外泌体；

⑶【ctDNA发现】ctDNA是肿瘤细胞释放到血液循环中的DNA，是cfDNA（细胞游离DNA）的一部分；cfDNA最早是在1948年被发现的，1977年，发现癌症患者血清和血浆中cfDNA浓度升高（肿瘤细胞释放ctDNA所致）；

⑷【ctDNA释放】迄今为止，主要发现两种ctDNA释放机制：“被动”（凋亡、坏死和吞噬等，是ctDNA释放的主要机制）和“主动”（活细胞主动释放）；

⑸【ctDNA大小】cfDNA由150~200bp的双链DNA组成，通常以核小体的形式存在（~166bp，ctDNA默认大小）；有研究显示，ctDNA片段比其他非癌细胞的cfDNA片段更短（~130-150bp）;

⑹【ctDNA含量】ctDNA含量因人而异，在0.01%~90%不等，主要取决于肿瘤类型，位置，负荷，分期和血管化水平等，同时，也可能受到非恶性过程的影响，包括运动、炎症和组织损伤；

⑺【ctDNA标本】大多数研究都把血液（血浆和血清）作为ctDNA检测的首选体液，但也可以使用尿液（泌尿生殖肿瘤等），胸腹水（胸腹腔原发或转移肿瘤等），脑脊液（脑肿瘤原发或转移肿瘤等），唾液（口腔癌等）等，肿瘤的解剖位置决定了哪种体液更适合液体活检；

⑻【ctDNA应用】ctDNA的检测适用于癌症早期筛查，分子分层（个性化用药指导），耐药性监测，预后判断，MRD评估等；

⑼【ctDNA半衰期】ctDNA的半衰期很短，在16分钟~2.5小时之间（EDTA管建议4-6小时内处理，cfDNA管建议2-7天内处理）；

⑽【ctDNA一致性】ctDNA检测与组织检测之间存在良好的相关性，在70%~90%左右，特别是在早期肿瘤中，由于肿瘤的异质性，晚期肿瘤的一致性会低一点（ctDNA更能全面反应肿瘤突变信息）；一般来说，ctDNA检测与组织检测之间的一致性很大程度上取决于肿瘤类型、分期和使用的检测方法等；

⑾【ctDNA克隆性】一般认为，在ctDNA中发现突变丰度最高的肿瘤变异是主克隆性变异（存在于大多数癌细胞中），而不是亚克隆性变异，这一结果在TRACERx NSCLC研究中得到证实；

⑿【ctDNA灵敏度】影响ctDNA检测灵敏度的主要因素包括分析极限，采样量，输入分子数，肿瘤负荷，检测方法（覆盖深度，panel覆盖均一性等）等；

⒀ NCCN NSCLC 2021版指南指出，ctDNA检测通常具有很高的特异性，但灵敏度较低，假阴性率达到30%（需要在组织中验证ctDNA阴性的检测结果），同时，亦指出：“ctDNA分析及其检测性能的标准还未确立，与基于组织的检测相比，没有关于此类检测性能特征的指南”；

*目前，FDA和NMPA对于ctDNA检测用于癌症个体化治疗（CDx）的批准是有限的

⒁ 为建立NGS ctDNA行业标准和技术指南，美国FDA领导的MAQC-SEQC2（测序质控阶段II，也称MAQC IV）便进行了这样一项工作：分析一系列NGS技术的分析性能验证项目（包括ctDNA靶向测序研究），旨在解决不断发展的NGS技术临床应用相关问题，以评估FDA管制产品的安全性和有效性；

MAQC（基因芯片/测序质控）协会在2005~2014年间完成了三个项目（即MAQC I，II和III），发表了约30个项目的研究结果；

⒂ FDA领导的SEQC2（MAQC IV），于2018年针对ctDNA靶向测序研究组织了一场ctDNA battle（模拟~160bp片段），参赛选手包括5家全球领先的肿瘤靶向NGS检测试剂盒厂商：ROC（罗氏），ILM（因美纳），IDT，BRP（燃石）和TFS（赛默飞），通过battle来建立一套独特的参考资料和注释，并为ctDNA的标准化能力测试建立了分析框架；

*来自美国，英国，中国和澳大利亚的12个实验室进行单盲检测，每个实验室使用1个或多个参与的ctDNA panel进行测序分析

⒃ 该研究结果于2021年4月12日发表于《Nature Biotechnology》，结果显示：当ctDNA VAF≥0.5%时，所有检测方法都可以可靠的检出（具有较高的灵敏度和重复性），但在ctDNA VAF<0.5%时，检测结果通常不理想，并且各检测方法之间存在差异性；

⒄ ctDNA battle数据分析（25ng cfDNA投入量，约7,500拷贝）；

① ctDNA覆盖深度：测序的单片段中位覆盖深度在1,235X~4,698X之间，ROC（4,698X）>BRP（4,528X）>TFS（3,280X）>IDT（2,476X）>LIM（1,235X），有效片段回收率为 63%>60%>44%>33%>17%，意味着ctDNA建库技术方面ROC（罗氏）和BRP（燃石）表现最好；

② panel覆盖均一性：上面说到ROC（罗氏）和BRP（燃石）的ctDNA覆盖深度相似且最高，但与ROC相比，BRP的panel覆盖均一性更好（IOR=0.23 vs 0.35），覆盖均一性最好的是BRP（燃石）和IDT；

③ ctDNA灵敏度：最灵敏的检测方法是BRP（燃石）和IDT，在VAF为0.3%~0.5%时，灵敏度>90%，这说明，单纯的覆盖深度并不一定意味着灵敏度就高，尽管IDT的单片段覆盖深度较低，但它比ROC的灵敏度更高，这一结果可能（至少部分）归因于IDT panel的覆盖均一性高，强调除了总体覆盖深度之外，panel均匀覆盖的重要性（可提高检测灵敏度）；

④ ctDNA准确度：最准确的检测方法是BRP（燃石），其灵敏度与IDT相当，但精度（Precision）优于IDT；

⑤ ctDNA假阳性：最低的是BRP（燃石）和ILM（因美纳），分别为0.030 FP/kb和0.039 FP/kb；尽管5种ctDNA检测厂商在片段覆盖深度，灵敏度上存在差异，但假阳性率都很低（均采用了UMI），而且大体相似，因此灵敏度才是整体分析性能的主要决定因素，而不是精度；

⑥ ctDNA重现性：与灵敏度相似，ctDNA VAF≥0.5%时重现性普遍较高，但在0.1%~0.5%时，重现性相对较低，灵敏度是测定重现性的决定因素；尽管样本和组间差异很大，研究人员在实验室内和实验室间比较中没有观察到重现性的显著差异，这意味着，所有参与的ctDNA panel检测产品和生信分析都是稳定的，结果的波动性来自随机而非系统性的室间差异；

⑦ ctDNA稳定性：总的来说，在给定的cfDNA量输入水平上，一个检测方法获得的片段覆盖深度越深，该检测方法对输入量的变化就越稳定，其中BRP（燃石）是最稳定的；

⑧ TFS扩增子：TFS（赛默飞）扩增子试验和杂交捕获试验的性能是相似的，在实验室内和实验室间比较中也没有观察到重现性的显著差异（稳定）；

⒅ 本研究评估的5种检测方法性能特征与几家没有参与本研究的ctDNA测序供应商（基于内部检测）所报告的结果大致相似，如：

Guardant360 CDx：ctDNA VAF≥0.4%时灵敏度为~94%，VAF在0.05% ~ 0.25%范围内灵敏度下降至~64%；

FoundationACT：ctDNA VAF>0.5%时灵敏度为~99%，VAF在0.25% ~ 0.5%范围内灵敏度为~95%，VAF在0.125%-0.25%范围内灵敏度下降至~70%；

MSK-ACCESS：ctDNA VAF>0.5%时灵敏度为~98%，VAF在0.1% ~ 0.5%范围内灵敏度下降至~74%；

⒆ 0.5%以下的VAF对于ctDNA检测是一个挑战，提高对于0.5%以下突变检测的灵敏度应该是目前正在发展的ctDNA检测的优先事项，增加血浆量，优化血浆cfDNA提取、目标捕获和文库制备转化率可能会增加覆盖深度，从而提高低频突变的检出率；此外，需要进一步创新，比如在cfDNA的背景下选择性富集ctDNA片段；

⒇ 《Nature Biotechnology》原文“赤果果”的在夸BRP（燃石），而且非常的明显，这意味着燃石的液体活检技术受到了FDA领导的SEQC2认可，也意味着中国的液体活检技术已经达到国际领先水平，对国内的液体活检发展来说，是一件好事。

参考资料： 

1.Deveson IW, Gong B, Lai K, LoCoco JS, Richmond TA, Schageman J, Zhang Z, Novoradovskaya N, Willey JC, Jones W, Kusko R, Chen G, Madala BS, Blackburn J, Stevanovski I, Bhandari A, Close D, Conroy J, Hubank M, Marella N, Mieczkowski PA, Qiu F, Sebra R, Stetson D, Sun L, Szankasi P, Tan H, Tang LY, Arib H, Best H, Burgher B, Bushel PR, Casey F, Cawley S, Chang CJ, Choi J, Dinis J, Duncan D, Eterovic AK, Feng L, Ghosal A, Giorda K, Glenn S, Happe S, Haseley N, Horvath K, Hung LY, Jarosz M, Kushwaha G, Li D, Li QZ, Li Z, Liu LC, Liu Z, Ma C, Mason CE, Megherbi DB, Morrison T, Pabón-Peña C, Pirooznia M, Proszek PZ, Raymond A, Rindler P, Ringler R, Scherer A, Shaknovich R, Shi T, Smith M, Song P, Strahl M, Thodima VJ, Tom N, Verma S, Wang J, Wu L, Xiao W, Xu C, Yang M, Zhang G, Zhang S, Zhang Y, Shi L, Tong W, Johann DJ Jr, Mercer TR, Xu J; SEQC2 Oncopanel Sequencing Working Group. Evaluating the analytical validity of circulating tumor DNA sequencing assays for precision oncology. Nat Biotechnol. 2021 Apr 12. doi: 10.1038/s41587-021-00857-z. Epub ahead of print. PMID: 33846644.