病原细菌产生耐药性，能够降低细菌感染后的药物治疗效果，并增加细菌感染和传播的风险，是造成食品安全问题和健康威胁的重要因素。细菌耐药性可分为固有耐药（intrinsic resistance）和获得性耐药（acquired resistance）两种。在获得性耐药中，携带耐药基因的质粒可导至耐药性在同种不同株、或不同种属的细菌中快速传播；因此，迫切需要研究者对抗生素耐药性、尤其是质粒携带的耐药基因进行监测、以及对耐药机制进行研究。
确定菌株中重要耐药基因是否由质粒携带、以及质粒复制型别，是评价菌株耐药获得和传播风险的重要指标。针对此目的，目前主要应用基于抗生素耐药基因的探针标记联合Southern印迹、以及基因组测序技术，但这些方法流程复杂、耗时较长，且当探究耐药基因在质粒上的共存情况时，需要获得质粒完成图，就必须采用二代+三代的基因组测序策略，成本高、耗时长、需要专业生物信息分析。 在中国疾病预防控制中心传染病预防控制所团队近日发表的文章中，建立了一种简便、灵敏的质粒传播耐药基因及鉴定质粒复制子类型的检测方法。研究中将沙门菌核酸经S1核酸酶处理后使用脉冲场凝胶电泳（PFGE）进行分离，回收质粒电泳条带后作为微滴式数字PCR（ddPCR）的模板进行目的基因鉴定（称为S1-PFGE-ddPCR方法），测定的质粒携带耐药基因在回收质粒带上的拷贝数明显高于背景噪声。这个方法原理是该回收质粒所携带的共存基因具有相同的ddPCR反应、及相同的拷贝数，并明显区别于背景核酸模板（在PFGE电泳凝胶中，泳道凝胶内实际含有破碎的质粒和染色体核酸片段，形成背景“污染”，并可导至扩增信号，也因此使用ddPCR会使拷贝数比较鉴定更准确）。这些结果与质粒完成图测序结果一致。与Southern印迹和完整质粒测序策略相比，S1-PFGE-ddPCR方法耗时更短，数据易于分析。因此，该方法为质粒携带的耐药基因检测提供了一种节省时间、更简便的方法，有望成为检测质粒携带的共存耐药基因的有价值的工具。
图1. S1-PFGE-ddPCR实验流程 S1-PFGE可以分离回收得到纯度较高的质粒核酸片段。
图2. S1-PFGE显示各菌株中的质粒 所获得的质粒核酸即可作为模板、使用微滴式数字PCR（ddPCR）对目的基因进行鉴定。ddPCR是第三代的PCR技术，通过油包水微滴介质将核酸分子包被起来，在每个微滴中独立进行PCR反应。这种方法可以对核酸拷贝数进行绝对定量，无需借助标准曲线也避免了标准曲线引入的误差，也不受Ct值偏差的影响，所以ddPCR在准确性上优于实时荧光定量PCR（qPCR），利于区分背景信号，并且能一定程度下耐受PCR抑制剂对实验的影响。
图3. ddPCR实验流程 使用本研究构建的方法进行了菌株测试，这些耐药沙门菌携带含耐药基因的质粒，用二代+三代基因组测序获得了这些质粒的完成图序列。共设计了针对6个靶基因位点的检测引物探针，分别是3个耐药基因（mcr-1、blaCTX-M-55和blaCTX-M-14）和3个质粒复制子基因（IncHI2、IncI2和IncX4）。使用qPCR优化实验条件后直接用于ddPCR检测。使用S1-PFGE-ddPCR方法鉴定质粒复制型及其携带耐药基因、与质粒序列测定结果完全一致，表明S1-PFGE-ddPCR方法的准确性为100%。通过梯度稀释实验验证，ddPCR的检测限为2.02*10-6ng/μL，qPCR的检测限为2.02*10-4ng/μL，对应34.6的Cq值，显示ddPCR的检测限比qPCR低两个数量级，更加灵敏。
图4. ddPCR与qPCR的梯度稀释检测结果对比 从时间流程看，S1-PFGE-ddPCR的耐药质粒鉴定方案的耗时相比测序法短20小时以上，比Southern印迹法短30小时以上，节省了一天左右的实验时间，而且无需进行待检基因探针的标记、凝胶电泳后的核酸转膜、探针杂交显色等复杂步骤。
图5. S1-PFGE-Southern印迹、S1-PFGE-ddPCR与质粒测序工作时间对比 研究者认为 建立的S1-PFGE与ddPCR联合的鉴定策略可以替代S1-PFGE-Southern 印迹方法，用于对质粒复制型的鉴定、以及鉴定目标耐药基因是否由该质粒携带、是否共存于同一质粒。S1-PFGE-ddPCR方法具有检测效率高、灵活、简便、成本低等优点，这种方法可以进一步扩展到质粒中更多目的基因的鉴定。该方法可用于质粒携带的耐药基因和耐药细菌的检测和分析，并用于细菌耐药性和耐药传播风险的监测。 |
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