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如何做好一款qPCR产品？

2021-2-19 14:04| 编辑: 归去来兮| 查看: 2646| 评论: 0|来源: IVD开发者联盟

摘要: 实时荧光PCR就是动态检测在PCR过程中荧光强度的变化，获得PCR扩增的动力学曲线，借以实现对模板的定性或定量分析。简单地说，实时PCR就是PCR的在线分析技术。实时荧光PCR通过以下方式实现：荧光探针：指的是能与引物 ...

实时荧光PCR就是动态检测在PCR过程中荧光强度的变化，获得PCR扩增的动力学曲线，借以实现对模板的定性或定量分析。简单地说，实时PCR就是PCR的在线分析技术。

实时荧光PCR通过以下方式实现：

荧光探针：指的是能与引物之间的靶序列杂交并发出荧光的寡核苷酸，具有靶序列特异性。常用于实时PCR的探针类型主要有5′-水解探针、分子信标、杂交探针和置换探针等。
荧光染料：嵌入核酸双链发出荧光的染料如溴化乙锭、SYBRGreen I、LCGreen和SYTO9等。

实时荧光PCR检测试剂研发的基本原则：

适用的疾病类型：实时PCR其适合的疾病目前基本集中于传染病领域。
靶基因的选择：所谓靶基因，就是实时PCR扩增检测的靶序列对应的基因，靶基因的选择必须满足如下条件：

①具有高度特异性；

②具有相对的序列保守性；

③靶基因的拷贝数因素；

④靶基因的形态因素。

3. 探针类型选择的原则

实时PCR检测的探针类型：主要包括5′-水解探针、杂交探针、分子信标、以及置换探针。
实时PCR检测的探针选择应遵循以下原则：

①知识产权原则；

②性价比原则；

③容易实现原则。

4. 内对照的设置原则

实时PCR诊断试剂检测临床微生物，无论定性检测还是定量检测，均需要有内对照；在肿瘤诊断方面检测基因表达水平时，则需要设置参考基因。

（1）内对照：又称内部阳性对照，指的是检测体系内有别于靶基因的阳性对照品，用于提示假阴性的发生及水平。

（2）参考基因：对于人源基因的定性或定量检测，需要选择参考基因，参考基因不同于内对照之处在于，参考基因不必与靶基因在同一反应检测，也不要求其扩增效率与靶基因接近，最重要的要求是其拷贝数稳定。

5.筛查及定性与定量

实时PCR在实际应用中，根据检测目的差异，有筛查、定性检测和定量检测之分。它们之间的一个明显区别在于对照的设置上，筛查检测可能无需设置任何对照，定性检测需设置阳性对照和阴性对照，定量检测则需要设置定量标准品。

（1）筛查：依其用途可分为个体筛查和群体筛查，前者强调样品周转时间和集成化，后者则强调检测通量和批量处理能力。

（2）定性检测：强调检测结果的准确性，即要求临床灵敏度和特异性达到或者接近100%。

（3）定量检测：强调定量结果的准确性，由检测结果的重现性决定。

实时荧光PCR检测试剂研发的关键要点

样品的制备

样品制备过程依赖于样本类型，但不外乎液化、裂解和核酸回收等基本步骤。

阳性对照的类型

阳性对照（内部与外部）要求最大程度地模仿真实样品中靶基因存在的环境和状态，且稳定，不易降解。用质粒作阳性对照，虽然应用广泛，但是远非理想的对照品。

绝对定量的方法

绝对定量：是获得样品中靶基因的绝对数量，如病人血清中病毒载量的检测。

在实时PCR中，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。对待测样本进行定量时，根据待测样本的Ct值，即可从标准曲线方程中计算出待测样本的起始拷贝数。

相对定量的方法

相对定量：是通过检测靶基因相对于内参基因的表达变化来实现的，包括：标准曲线法、2-△△Ct法、Pfaffl法。

内参基因：指在机体的各组织和细胞中，一些基因表达相对恒定，在检测其他基因的表达水平变化时常用它来做内部参照物。

内参基因须满足以下条件：

(1)在待测样本中的表达是稳定的；

(2)实验中的干预因素对内参基因表达没有影响；

(3)能与待测靶基因同时进行相同的PCR扩增。

实时PCR扩增体系的优化

一个理想的实时PCR扩增体系，其扩增效率应接近100%。但由于荧光探针的存在，导至扩增受阻。与普通PCR相比，实时PCR效率会有所降低。因此，建立实时PCR体系，均需优化反应条件以提高扩增效率。如：

（1）扩增片段的长短

（2）各组分的浓度

（3）扩增反应的程序

参考资料：MLS and IVD，作者:王逊

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