循环肿瘤细胞检测技术分类，优点和局限性！

目前开发的CTC检测技术一般分为四个步骤：(1)捕获，(2)富集，(3)检测，(4)释放。捕获步骤是CTCs与材料（如物理相互作用和抗体/抗原相互作用）之间的特定相互作用，如磁珠，微流控芯片；富集步骤是指从血液中分离CTCs；富集后，CTCs可以通过荧光（如荧光显微镜，荧光分光度计和流式细胞仪）[1, 2]、表面增强拉曼散射(SERS)[3]或电阻抗[4]进行检测；CTCs释放后可进行进一步的表型鉴定和分子分析（如RNA分析和细胞代谢分析）。

当前CTC检测技术分类技术树

这些CTCs检测技术的重要技术指标包括回收率、纯度和检出限（LOD），见表1。回收率定义为富集CTCs在血液中占总CTCs的数量百分比，也称捕获效率或富集效率。纯度是指富集CTCs的数量占富集样品中细胞总数的百分比。LOD是可检测到血液中CTCs的最低浓度。

 没有富集步骤的CTCs检测也称为直接检测，包括扫描共聚焦显微镜和表面增强拉曼散射（SERS）技术。

共聚焦显微镜技术是一种快速、自动化的高通量筛选方法，基于微流体和多波长扫描共焦探测技术而开发[5]。血液中的细胞首先同时标记多个抗体，这些抗体与不同的荧光剂结合。血液通过微流控通道被泵出，用共聚焦显微镜扫描，根据荧光信号和标记方法，可以自动计数和报告CTCs的数量。

特点：（1）由于微流控通道中的流速有限，每个样本的检测时间太长(分析7.5mL的血液需要3.5h左右)；（2）假阴性率达到40%以上；（3）由于需要几种荧光染料结合抗体来标记血液中的细胞，导至样品的检测成本较高；(4）不能分离CTCs进行下游表型鉴定和分子分析。

SERS是另一种快速分析外周血中CTCs的方法，它是基于具有靶向配体的高度特异性和敏感的SERS活性纳米颗粒来识别健康血细胞中的CTCs。首先将外周血样本添加到外周血淋巴细胞分离介质中，然后在室温下离心。含有白细胞(WBCs)和CTCs的低密度细胞层被转移到新的管中，与SERS活性纳米粒子孵育，并用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤，最后利用拉曼系统对样品的SERS光谱进行分析[6, 7]。

特点是：（1）CTC检测过程不易自动化；（2）需要配体来捕获血液中的CTCs，检测试剂成本高；（3）不能分离CTCs进行下游表型鉴定和分子分析。

血液中低浓度的CTCs可以通过两种不同的方式富集。一种是阴性富集，捕获非目标细胞和洗脱靶细胞；另一种方法是阳性富集，捕获CTCs并洗脱健康血细胞。

Lara等首次开发了一种阴性富集技术来获取血液中的稀有细胞，富集过程包括红细胞裂解、CD45抗体筛选白细胞、流过系统进行免疫磁选，最后使用自动细胞计数、过滤和视觉计数或细胞螺旋分析进行细胞分析过程[8]。为了提高CTC负富集的效率，Hyun[9]等开发了一种几何活化表面相互作用（GASI）的微流控芯片，利用人字形有效地捕获大量血液细胞（3a）。通道为人字形结构，可产生横向流动，促进细胞上的抗原与通道表面的抗体之间的有效接触(3b和c)。这是第一次尝试用负富集微流控芯片从转移性癌症患者中富集CTCs。该GASI芯片成功地富集了CTCs，同样的方法可能有助于收集其他类型的循环稀有细胞，其表型尚不清楚。在1毫升血液中，分离的CTCs的数量从1到51不等。

阴性富集CTC检测技术特点包括：（1）不依赖于CTCs的生物标志物表达(如EpCAM)；（2）可收集完整的CTCs，可进行细胞和分子分析等下游研究；（3）易于自动化。 

阳性富集捕获CTCs并洗脱健康血细胞，分为体内富集和体外富集。

• 体内富集

在体内，CTCs的正富集捕获和丰富了大量的稀有CTCs。Galanzha等[10]提出一种在小鼠血流中磁捕获CTCs的方法，然后进行快速光声检测。该方法通过整合体内多重靶向、磁富集、信号放大和多色识别，使CTCs能够从荷瘤小鼠血管中的大量血液中浓缩，这可能为癌症的早期诊断和预防人类转移显示出潜力。

体内富集在CTC检测特点是：（1）富集时间非常长；（2）技术不成熟，没有关于CTC纯度的数据报告；（3）成本很高：CTC捕获需要抗体。

• 体外富集

1、不需要配体捕获。在没有特定配体结合的体外CTC检测被称为“物理捕获”，主要依赖于CTCs的物理性质（细胞密度、细胞大小和纳米棒表面）来捕获。优点是：（1）不依赖于CTCs的生物标志物表达(如EpCAM)；（2）富集到的CTCs是完整的；（3）富集时间短，并可用于下游分析；（4）成本低。缺点是：这些技术的商业化难度大，富集得到的CTCs纯度低。

2、与配体捕获。

2.1 单一方式富集。指只有以下具有配体捕获的富集技术之一用于CTCs检测：密度梯度沉降、尺寸排除过滤、条形码颗粒、自行式微机械、磁珠和微流控芯片。

（1）密度梯度沉淀：配体被结合到具有高密度的微球表面以捕获CTCs，通过选择性沉淀，有效地从健康血细胞中分离出微球-CTC复合物。特点是：1）配体的使用增加了检测成本；2)微珠可能会影响光散射、猝灭，从而干扰荧光检测；3）微珠可能被内化到CTCs中，从而影响CTCs的活性；4）与微珠-CTC复合物混合的游离微珠会干扰CTCs的精确检测和分析。

（2）磁珠：配体被结合到磁珠表面以捕获CTCs，通过外部磁场将磁珠-CTC复合物与健康血细胞分离，这是一种相对成熟的技术。特点是：1）检测成本高；2）微珠的内化可能影响CTC的可行性；3）依赖CTC标记的表达，如EpCAM；4）整个过程（CTC捕获、富集和检测）不容易自动化。

（3）微流控芯片：微流控可在极小尺寸上达到精确控制。从患者中提取的血液样本量很小，配体被接到微流控芯片上，以捕获流动血液中的CTCs，从而从健康血细胞中分离出CTCs。

基于配体捕获的微流控芯片有许多不同的种类，其主要区别在于微芯片的设计，包括通道结构和衬底涂层。Nagrath等开发了一种独特的微流控芯片，用于CTC的富集，该芯片由一系列具有抗EpCAM抗体功能化的微柱组成[11]。决定CTC芯片上细胞捕获效率的两个基本参数是：1）流速：因为它影响细胞-微柱接触的持续时间；2）剪切力：必须足够低，以确保最大的细胞-微柱附着。在精确控制的层流条件下，微流控芯片在116个（99%）样品中的115个中成功地鉴定了癌症患者外周血中的CTCs，其范围为每毫升5-1281个CTCs，纯度约为50。

微流控芯片富集特点是：1）处理样本量有限；2）CTC富集时间长；3）剪切力必须足够低，以确保最大的细胞基底附着。

2.2 双模态富集

为了提高血液样品中CTC的富集效率，上述六种富集技术中的两种可以结合在一起。组合富集技术被称为双模态富集，如密度梯度沉降加尺寸排除过滤。然而，该技术尚不成熟，尚未得到广泛的研究。

CTCs检测是对抗癌症的关键工具，在癌症早期诊断、治疗监测、复发监测和用药指导中起着关键性作用。“稀有性”是CTCs检测最大的难点，如何从几亿个血细胞中精准捕获几个CTCs细胞？富集效率极为重要。目前市场上CTCs的检测技术较多，阴性富集技术是公认富集效率最高，应用最普遍的方法。不依赖CTCs大小、理化性质及表面标志物，可将所有类型CTCs细胞一网打尽。