这是本公众号在2020年的收官之作，在新冠和非洲猪瘟两种病毒面前，检测一夜之间成为了热点。作为一名普通的实验室检验员，我能做的只有尽自己的绵薄之力，传播一些知识，分享一些经验，以此来致敬这一年来或奋战在抗疫一线，或坚守在本职岗位，舍己为公的英雄们。 本人一直本着“授人以鱼，不如授人以渔”原则。因为我们面对的世界瞬息万变，只有掌握了处理的方法才能随机应变。目前的市场上每一种产品都有成百上千的品牌，我们每次只能评价几个产品，不足以代表整个行业的情况；即使是同一个品牌的产品也存在不同货号和批次之间的差异；很多实验室用品的评价，比如采样拭子、DNA去除剂、离心管等，又暂时没有国家和行业的标准，有很多方法是我个人根据经验的设计，评价的科学性和全面性不敢100%保证。每种实验室用品的评价都是十分必要的，先不必纠结评价方法是否高大全，有，好过无，做，好过不做。贵在持续尝试，持续改进。实验室中不能存在任何“隐秘的角落”。
(图片来网络，版权归原作者所有) 案例分享：当PCR实验室发生污染时该怎么做？ 受到了大家的广泛关注，说明实验室核酸污染是目前PCR实验室中比较严重的问题。很多的朋友很关注到底哪种DNA去除剂有效。DNA去除剂作为实验室污染去除的重要工具，如果DNA去除效果好确实能够帮助实验室快速去除污染。但是DNA去除剂并非去除污染的决定性因素，实验室污染重在预防，真的发生了污染，很难精确找到污染源，还需采取系统性措施（如何预防和处理PCR检测实验室的核酸污染？）。 一、DNA去除剂的试验设计 1.DNA去除剂 本次试验共选择了5种市售DNA去除剂，编号1-5和3种实验室常用的消毒剂：84消毒液（次氯酸钠含量11-14.9 g/L）、75%医用酒精和过氧化氢溶液（2.5%-3.5%），编号6-8。 2.测试质粒 由于考虑到大部分实验室污染的CT值都会高于30，因此本次使用的P72基因质粒浓度为137 copies/μL，荧光定量PCR CT为 31.07 。 3.测试方法 数字PCR：用于定量质粒的拷贝数。 荧光定量PCR：绘制标准曲线为不同去除剂处理后的测量结果赋值。 普通PCR：由于质粒浓度太低，用普通PCR电泳均未见条带。 4.评估指标 DNA去除效率=（初始质粒浓度-处理后剩余质粒浓度）/初始质粒浓度 金属腐蚀性:将新手术剪放置在不同溶液中浸泡4天，观察是否产生锈斑。 二、DNA去除剂的试验 1.常规的DNA去除剂效果试验 按照大部分DNA去除剂公司提供的试验方法，将质粒与DNA去除剂按照等体积混合，室温作用10min后，进行qPCR扩增，与质粒和水混合的阳性对照进行比较。结果见表1： 表1 DNA去除剂与质粒混合直接扩增结果
结果显示：除了产品4几乎没有作用，其他产品的DNA去除效果均高于99%。面对这个结果，直觉告诉我一定是哪个环节有问题。根据经验医用酒精没有这么强大的DNA去除效果，却可以干扰qPCR反应中DNA聚合酶的活性，因此本次试验获得的阴性结果，很可能是DNA去除剂抑制了qPCR反应而导至的假阴性，而非DNA去除剂对质粒的降解。 2.改良版的DNA去除剂效果试验 本次试验将质粒与DNA去除剂按照等体积混合，室温分别作用10min，20min和30min，进行核酸提取后，进行qPCR扩增，与质粒和水混合的阳性对照进行比较。结果见表2： 表2 DNA去除剂与质粒混合后提取扩增结果
结果显示：提取后再扩增和直接扩增的结果存在显著差异。作用10min时，产品1和6g/L的84消毒液DNA去除效率最高，医用酒精的DNA去除率达到了75.9%，过氧化氢则达到了84.9%，产品2和产品5的DNA去除效率不到50%，意味着还不如医用酒精有用。 作用时间设为10min，20min，30min。随着作用时间的延长，DNA去除效率有所增加。作用30min的DNA去除率，产品1和6g/L的84消毒液达到100%，过氧化氢超过90%，产品3，产品4和酒精超过80%，产品2和产品5低于70%。 个人觉得只有产品1、84消毒液和过氧化氢达到我对DNA去除剂的预期，其他产品和医用酒精差不多甚至还不如酒精。 3.DNA去除剂的金属腐蚀性试验 DNA去除剂对DNA的去除效果固然重要，其对金属物品的腐蚀性也是大家关心的指标，如果存在腐蚀性那么就不能用来擦拭金属台面和仪器。为了这个试验，笔者使用了8把全新的手术剪刀浸泡在不同去除剂中4天，观察是否产生锈斑或发生化学反应。
1-4号 0天
5-8号 0天 产品2的DNA去除剂在放入剪刀的第二天，去除剂变成了红色。
2号DNA去除剂浸泡剪刀24h
DNA去除剂浸泡4天后的剪刀
2号
5号
84消毒液 浸泡4天后将剪刀捞出放入白瓷盘中观察，2号发生了化学反应，5号明显生锈，84消毒液浸泡的剪刀出现锈斑。 试验结果表明：部分DNA去除剂可以和金属剪刀发生化学反应（2号）和引起明显的锈蚀（5号），这类DNA去除剂就不能用于金属物品。84消毒液虽然有很好的DNA去除效果，但是可引起金属生锈不能用于金属物品。 4.84消毒液的最低有效浓度 个人觉得本次试验的一大收获就是发现84消毒液具有强大的DNA降解作用，但是由于其有金属腐蚀性和刺激性，使用时可用于清洁地面，非金属台面以及浸泡吸头、离心管等试验物品。 按照新冠病毒《特定场所消毒技术指南 》阳性污染物的处置规定，需要有效氯 5g/L～10g/L 的含氯消毒剂作用30min，因此本次试验使用的84浓度约为6 g/L ，在该浓度下既可杀灭病毒也可降解DNA，一举两得。但是常用的地面、墙壁、物品表面消毒：要求使用有效氯1g/L 的含氯消毒液 ；衣服、被褥等纺织品消毒：要求使用有效氯 0.5g/L 的含氯消毒液。这些浓度下的84消毒液是否同样能降解DNA呢？ 表3 84消毒液不同浓度的DNA去除效果
试验结果表明：作用5min时，有效氯浓度大于等于1.2gL的84消毒液，可将137 copies/μL质粒完全降解。作用10min时，有效氯浓度大于等于0.6gL的84消毒液，可将137 copies/μL质粒完全降解。 5.擦拭物体表面的干燥时间试验 DNA去除剂的使用方式主要是擦拭物品、实验台面、地面等表面，其次是物品的浸泡。在擦拭物体表面时，DNA去除剂的干燥时间决定了DNA去除剂与DNA的有效作用时间。遇事不决，试验解决！ 首先看下实验室内的温湿度，温度：25℃，湿度：不可描述%。本试验室湿度太低，必然会影响试验的代表性，所以南方的朋友可以反馈下你们的试验结果。
实验室的温湿度 分别用干棉球蘸水和酒精在实验台面上各擦拭了7cm直径的圆（ 水在上，酒精在下），然后计时。约1 min酒精消失，约5 min水消失。
0 min 1 min（酒精消失）
2 min 3 min
4 min 5 min（水消失） 当然这个试验的最大不确定性在于手法的轻重，液体量的多少，后来又重复了几次，水和各种DNA去除剂的干燥的时间在3-13min之间，大部分在10 min以内，因此本人认为用作表面擦拭的DNA去除剂去除效果评价试验主要应考察作用时间为10min或10min以内的DNA去除效果。如果用途为浸泡物品，重点考察30min的DNA去除效果。 6.想做而没做的试验 实验室的姑娘们最关心的是DNA去除剂伤不伤手。 皮肤刺激性试验需要用豚鼠皮肤来测试，没钱买豚鼠.... 粘膜刺激性试验需要用兔子的眼结膜来测试，没钱买兔子...... 建议大家还是不要完全相信DNA去除剂上标识的无毒无害无刺激，使用时应做好常规防护。 三、DNA去除剂的评价标准 结合本次试验的结果，本人认为DNA去除剂的评价标准为以下几点： 1.DNA去除试验：应选择质粒或从实际样品提取的核酸作为受试物，DNA去除剂与核酸作用一定时间，需经核酸提取（去除DNA去除剂）后再进行qPCR或普通PCR扩增。 2.DNA去除效率：用于表面擦拭使用，10min的DNA清除率应大于90%, 用于浸泡使用，30min 的DNA清除率应大于90%。 3.金属腐蚀性：用DNA去除剂浸泡金属物品（如剪刀）至少72h，剪刀上不能出现锈斑或与金属发生化学反应。如有金属腐蚀性，使用用途需标明不可用于金属物品。 4.其他：不能含有致畸致癌致突变作用的成分，应提供皮肤刺激性和粘膜刺激性试验数据。 本次试验探索性的设计了一套用于评价DNA去除剂的方案，希望能给各领域的PCR检测实验室提供一个参考，试验方案中如果有不合理的地方也请大家批评指正。本次测评的5款DNA去除剂只有产品1能达到要求，反映在此类产品中质量良莠不齐。产品1 10min的DNA去除率为98.2%，看似很高，但是很多试剂盒的阳性对照的质粒浓度达到10^5 copies/μL以上，即使DNA去除效率为99%，剩余的质粒浓度仍高达1000 copies/μL，这对PCR实验室依然是个很大的威胁。试剂盒的阳性质粒对照已经成为了一个重要的实验室污染源。84消毒剂既有良好的消毒性能又能清除DNA污染，虽然具有金属腐蚀性和刺激性，但是用于实验室地面和桌面等表面擦拭及实验物品的浸泡是一个物美价廉的选择。 |
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