一次性解决你的内参基因选择障碍

    在分子检测中内参基因不光是一个对照，也是检验结果质量的保证的重要环节。CNAS-CL02-A009 2018《医学实验室质量和能力认可准则在分子诊断领域的应用说明》中规定：

    内参基因通常使用持家基因或叫管家基因，看家基因（house-keeping gene）因为其表达水平受环境因素影响较小，而且在个体各个生长阶段的几乎全部组织中持续表达变化很小。

    管家基因的优点是与样品中的靶基因经历完全相同的处理程序，可以监控采样，运输，核酸提取和扩增的全部过程。缺点是不同物种，不同生理状态下，不同组织中的内参基因存在一定的差异。如果样品类型是口腔液，咽拭子等样品，管家基因的量很低可能导至实验不成立。如果检测的是环境样品则内参基因可能完全失效。

    常用的管家基因包括GAPDH、β-actin(BETA-actin)、18sRNA、B2M、HPRT和TBP等。

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一、常见的几种内参基因

1.GAPDH

   Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH是甘油醛-3-磷酸脱氢酶的缩写，经典的糖酵解反应中的一个酶。该酶广泛存在于众多生物体中，并且在细胞中含量丰富，占总蛋白的10%-20%。GAPDH基因有高度保守的序列，在同种细胞或者组织中的蛋白表达量一般是恒定的。故长期以来该基因被广泛用作qPCR或Western blot中的内参基因。

    GAPDH基因是糖酵解中的关键基因，在代谢中过程中的表达很容易受到多种因素的影响。如在细胞的增殖过程中，糖酵解代谢加大，GAPDH基因的表达水平很有可能被上调。有报道称，该基因可作为肿瘤发生的标志物，在肿瘤组织与正常细胞及癌旁正常组织比较时，GAPDH表达并不一致。

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2.β-actin/ACTB

    β-actin即β肌动蛋白，其mRNA表达数量高，是横纹肌肌纤维中的一种主要的蛋白成分，也是肌肉细丝及细胞骨架微丝的主要成分。在维持细胞结构、细胞内运动、细胞分裂等细胞生理活动方面发挥着重要的作用，该基因几乎在所有真核细胞中表达，广泛存在哺乳动物动物的组织与细胞内。

    对于actin蛋白有6种异构体组成，存在于组织分布特异性，不同actin之间具有较大的序列相似性(>90%)因此之间存在交叉反应。所以并不是所有的组织都适合以 β-actin作为看家基因，比如脂肪组织中 β-actin含量就很低。

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3.18S rRNA

    18S rRNA基因是编码真核生物核糖体小亚基的DNA序列，其编码基因rDNA（18S rRNA/rDNA）在生物演化过程中相当保守，存在于所有真核生物细胞中；rRNA合成的调节独立于mRNA，在影响mRNA表达的各种条件下，各种rRNA水平很少发生变化。

    rRNA转录易受到各种生物因素和药物的影响，在有丝分裂期间，28S、18S rRNA明显减少或不表达；另外rRNA不含poly(A)尾，在以oligo(dT)为引物的cDNA合成中不能被逆转录，所以建议在反转录的过程中除用oligo(dT)引物外，还要用18S作为反向引物。

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二、选择适合自己的内参基因

    没有一种内参基因在任何物种、任何器官、任何生理状态下都是恒定的，我们需要根据自己的试验目的和样本类型去筛选最适合的内参基因。

1.ICG

    北京基因组所生命与健康大数据中心开发了国际上首个实时定量PCR内参基因知识库——ICG（http://icg.big.ac.cn/index.php/Main_Page），对经生物学实验手段鉴定出的内参基因及其应用场景实现了有效的挖掘、整合及注释。

目前这个网站已经收录了

ICG知识库中动物的物种信息

    每个物种信息中包含了基本描述、内参适用的样本类型、内参基因的信息（名称、应用、genbank的accession号、引物序列，Tm温度和qPCR类型等信息）、内参基因的类型、评估方法等。

ICG知识库中人的物种信息（http://icg.big.ac.cn/index.php/Homo_sapiens）

ICG知识库中猪的物种信息（http://icg.big.ac.cn/index.php/Sus_scrofa）

    这个网站真是“一站式”解决内参基因的烦恼，从此“一站在手，内参无忧”。

2.其他常用工具

geNorm、NormFinder和BestKeeper是目前最常用的用于评估内参基因稳定性的软件。大家可以自行学习。

geNorm（https://genorm.cmgg.be/）

NormFinder（https://moma.dk/normfinder-software）

BestKeeper（https://www.gene-quantification.com/bestkeeper.html）

3.人类的内参基因

E. Eisenberg and E.Y. Levanon, Trends in Genetics, 29 (2013)（DOI:https://doi.org/10.1016/j.tig.2013.05.010）这篇文章中作者基于对NGS的RNA-seq数据分析列出了6万多种管家基因。有兴趣的可以去研究 （下载链接：https://www.tau.ac.il/~elieis/HKG/）。

4.商品化检测方法

    目前很多公式都有成品的管家基因检测方法，可以买回来试试。

    没有一种内参基因是万能的，针对不同的试验、不同的样本多试几种内参基因，适合自己的才是最好的。