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侧流免疫层析检测系统的研究进展

2020-10-26| 编辑: 归去来兮| 查看: 224| 评论: 0|来源: 中华检验医学杂志 | 作者:孔鑫 李光荣 刘靳波

摘要: 作者:孔鑫 李光荣 刘靳波侧流免疫层析(lateral flow immunochromatography assay,LFIA)是一种基于抗原、抗体免疫反应的经典床旁检测技术(point of care testing,POCT)。最初,研究人员采用纳米金制备层析试纸 ...


作者:孔鑫 李光荣 刘靳波

侧流免疫层析(lateral flow immunochromatography assay,LFIA)是一种基于抗原、抗体免疫反应的经典床旁检测技术(point of care testing,POCT)。最初,研究人员采用纳米金制备层析试纸条,用于尿人绒毛膜促性腺激素检测,即我们熟知的胶体金。但检测结果依赖人工判读,且检测灵敏度低、假阴性率高。随后,一些对层析膜进行简单图像采集、处理的仪器相继出现,LFIA结果判读实现自动、半定量化。


近年来,LFIA不断发展,检测性能得到很大提升,已逐步向定量检测过渡,其可检测样品多样(如全血、血浆、汗液、唾液,尿液等),并且能对核酸进行检测[1]。本文综述了LFIA检测系统的研究进展以及LFIA的商品化应用现状,以期为相关领域提供参考。


一、LFIA结构及定量检测

侧流免疫层析试纸条由样品垫、结合垫、层析膜、吸水纸和聚氯乙烯(polyvinyl chloride,PVC)底板五部分组成。单克隆抗体和二抗被预先固定在层析膜上以形成测试线或对照线,加入含待测物的样品后,待测物与结合垫上的标记抗体结合,随层析作用进一步被固定在T线上的单抗捕获。过量的标记抗体被C线上的二抗捕获,通过特定检测仪器读取T/C线上的标记物信号强度,并代入预先绘制的标准曲线,在保留LFIA优点的同时实现了LFIA对待测物的定量分析[2]

对于完整的LFIA定量检测系统而言,标记物、层析膜、检测仪是保障定量结果快速、灵敏、准确的基础。在近十年里,已研发出不同信号类型的灵敏标记物以及多种新型层析膜材料,还设计了一系列价格合理、结构紧凑的检测设备用于免疫层析结果的记录和量化。特别地,为保证定量结果溯源性,对试验中所使用的标记物、耗材、试剂、仪器及检测程序均可开展量值溯源工作,以使LFIA产品的检测结果溯源至国家或国际标准。可用经典的蛋白和分子检测方法,作为验证LFIA诊断效能的参比方法,如酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)等[3]

LFIA实现定量检测使得检测结果不受主观因素制约,大大提高了其在即时检测领域的应用深度与广度。下文就实现LFIA定量检测的三个重要组成部件即标记物、检测仪器、层析膜以及取得的应用进展进行详细阐述。


二、LFIA检测系统进展

(一)高灵敏标记物
纳米标记物的成功应用使LFIA迈向定量检测的新台阶,根据标记物产生的信号不同,将其大致分为三类:(1)有色型标记物:会产生肉眼可见的颜色;(2)荧光型标记物:在特定光源激发下可产生荧光;(3)其他标记物:包括纳米酶、磁珠等,分别产生酶学信号、磁信号。


1.有色型标记物:
纳米金(aurum nanoparticles,AuNPs)在水溶液中由于表面静电作用呈胶体状态,具有优异的理化性质且易于功能化,是LFIA中最常用的标记物。但AuNPs存在粒径分布宽、稳定性差、储存条件高的不足。近年来,已有研究采用油相合成、化学键合等方法来对AuNPs进行增强、组装、聚合,如二维黑磷[4],改良后的AuNPs既保留了原有特性,稳定性又得到很大提升,在微量药物、病毒糖蛋白的定量检测中,显示出广阔的应用前景。

碳纳米管(carbon nanotubes,CNTs)是由石墨烯片组成的无缝空心管状体,具有高比表面积、良好的机械强度和化学惰性。另外,自身黑色使AuNPs具有很强的辨识度,因此CNTs的灵敏度比AuNPs更高。但CNTs易于聚集,几乎不溶于任何有机溶剂。在CNTs表面添加亲水性的共价官能团,可改善CNTs的溶解性局限,并获得更好的稳定性,尤其适用于小分子化合物和特定蛋白的定量检测[5]


2.荧光标记物:
由于有色型标记物信号放大能力有限,现已将许多新型荧光材料用于LFIA的定量检测,常用的荧光标记物有量子点、镧系元素等。

量子点(quantum dot,QD)是一种半导体荧光纳米晶体,荧光强度大且稳定,其发光光谱可调、狭窄、对称,适用于微量物质的检测。单一的QD经过两亲聚合物修饰后,可制备成核壳型量子点,其稳定性更好、保存期更长。在肿瘤标志物和小分子药物的检测中,检测限(limit of detection,LOD)可低至5.8 ng/ml。以QD为标记物的LFIA,还适用于荧光猝灭的方法,较其他标记物具有更宽的线性范围,在感染性疾病诊断、肿瘤诊断试剂开发和药物监测领域前景可观[6]

镧系元素(lanthanide elements,LE)具有原子态发射、长荧光寿命、窄发射光谱、宽斯托克斯位移的特性,常用作基于时间分辨的免疫分析,在小分子药物检测中,表现出良好的重复性,LOD比最灵敏的AuNPs低约100倍。但LE在水溶液中存在低荧光产量的缺陷,可将LE与纳米微球等载体结合,以增加荧光产量[7]。上转发光粒子(up-converting phosphor,UCP)是由稀土金属元素合成的晶体材料,和其他标记物相比,UCP具有独特的上转发光现象、低背景干扰和高稳定性,非常适合于检测成分复杂的样品,如尿液、唾液等。检测结果与培养法和PCR法高度一致,可在20 min内检测10种食源性致病菌[8]

荧光微球(fluorescent microsphere,FMS)通常由纳米微球包裹荧光材料或在其表面偶联荧光物质制备而成,具有良好的亲和性和高比表面积,目前已经制备出包含有机染料、QD、UCP等荧光材料的FMS。但FMS合成步骤复杂、产率低、成本高,仅在生物酶、小分子药物的检测中有研究报道[9]


3.其他标记物:
拉曼散射(raman scattering,RS)指荧光物质的吸收光与发射光不等的现象,不同物质的拉曼散射不同,将拉曼分子与金属表面接触后可实现拉曼信号的放大,即表面增强拉曼散射(surface enhanced raman scattering,SERS),SERS信号稳定、灵敏,可用于多重检测生物大分子蛋白、病毒、细菌,但对特殊检测仪器的依赖,使得SERS在实际应用中并不广泛[3]。超顺磁珠是具有磁性内核和活性基团表面的复合纳米材料,具有易分离、信号稳定等优点,其结果不受样品中有色成分的影响,在微量激素、肿瘤标志物、药物检测中具有良好的应用前景,但超顺磁珠需要磁检测器或巨磁阻传感器,在一定程度上限制了其应用[10]。纳米酶是一类具有多孔结构的双金属纳米粒子,具有高比表面积和特殊的酶催化性能,但纳米酶合成困难、需额外的显色步骤。与胶体金相比,纳米酶灵敏度提高了两个数量级,其LOD和线性范围与商业ELISA试剂盒相当[11]


(二)检测仪器
1.金标检测仪:
针对不同标记物信号,需用不同的检测仪器。早期的免疫层析检测仪主要针对AuNPs设计,大多将T/C线的颜色信号转换成电信号或灰度图像,如光敏电阻法、图像处理法等,由于T/C线的宽度较窄,光敏电阻法的信号响应受到限制;图像处理法也存在对灰度图像的利用不充分的缺点。现已报道了多种新型金标检测仪,如光热成像分析仪、压力读数仪[4,12],通过分析仪检测T/C线温度、气压变化,经过简单的数字转换就可以得到定量检测结果,灵敏度比光敏电阻法高68倍,有望应用于生物大分子检测。


2.荧光检测仪:
随着荧光标记物的广泛使用,其配套的荧光检测仪也在不断的更新发展,为LFIA的检测提供了一种简单、快速、准确和定量的工具,不仅具有量化和客观解释结果的优势,还可以自动存档和传输结果。现有的荧光检测仪主要有直接检测荧光强度和智能手机两种模式。

直接检测荧光强度:通过光电探测器从T/C线中获取背景和荧光信号并转换成电信号,是上述荧光标记物信号检测的主要方式,在大型医院中有广泛应用,但这种模式需要完整的机电、发射及检测系统,使得整套仪器笨重、复杂,不利于便携化和即时诊断。

智能手机:采用智能手机自带的闪光灯和相机,可对荧光及化学发光信号进行激发和检测,使智能手机成为便携检测仪的新可能。You等[13]利用智能手机作为LFIA的检测器,配合相应的软件系统,可同时定量检测脑利钠肽与致瘤性2因子,LOD分别为17.46 pg/ml和29.92 ng/ml。现有的智能手机检测器具有良好的不同信号辨识度和检测微弱T/C线信号的能力,在疾病的家庭自检中具有极大的应用前景。

(三)新型层析膜
层析膜是进行层析作用的主要部件,对于保证免疫反应进行和实现多组分检测至关重要。膜背景发光、孔径大小及分析物通过膜的液体流速既是评价膜性能好坏的重要指标,也是研发膜材料的切入点。


1.减少背景发光:
大多数商用层析膜在可见光区域会产生明显的背景发光,其常见原因包括自发荧光、磷光和拉曼散射。在进行LFIA分析前,如何选择低背景发光的层析膜,是需解决的首要问题。Shah和Yager[14]应用激发-发射荧光光谱来系统地表征膜材料的自发荧光,并评估背景发光对分析性能的影响。为开发人员筛选低背景发光层析膜提供了一个简单的框架,使用该框架可减少耗时的实验优化过程,在对甲型流感病毒核蛋白检测中,LOD较未使用该框架前降低50%以上。


2.优化层析膜:
现有的LFIA层析膜具有更少的背景干扰、更好的稳定性和样品利用率。已有多种膜材料通过改变层析膜的孔径来控制液体流速,从而提高LFIA分析灵敏度。如水凝胶-纸杂化材料可以增加待测物的反应时间;海绵具有良好的层析作用和亲水性;纳米纤维材料具有高比表面积、高孔隙率、互连的多孔网络和灵活的可修饰性。Yew等[15]在NC膜上喷涂聚己内酯形成疏水涂层,以提高靶标与金纳米颗粒之间的相互作用率,灵敏度提高了大约十倍。另外,在进行全血样品分析时,可将层析膜与分离装置结合,以减少红细胞的空间位阻对待测物在膜上的流动造成的影响[16]


三、LFIA在核酸检测中的应用

1.偶联适配体:
目前大多数LFIA使用抗体作为靶标识别元件,但抗体的使用存在一些局限,如抗体成本高、热稳定性差、易受pH影响。由于适配体易于修饰且具有高特异性、稳定性,已有研究将适配体作为抗体的替代物用于LFIA,实现对核酸、蛋白质、小分子化合物的灵敏检测。与基于抗体的LFIA相比,适配体具有更高的灵敏度,适用于药物分析、疾病预防和靶向治疗领域[17]。同时,基于适配体的LFIA存在一些不足:适配体由指数富集获得,过程较复杂,价格昂贵;易受到钩效应影响,造成假阴性结果;可用的适配体性有限,与免疫测定相比,基于适配体的检测仍不成熟[18]


2.实现核酸检测:
特异性核酸序列检测在医学诊断、食品安全分析和环境监测中具有重要作用。近年来,结合了LFIA与核酸检测的侧流核酸生物传感器(lateral flow nucleic acid biosensor,LFNAB)在生物分析和临床诊断中的应用显著增加,具有操作简单、不需要复杂的分析过程和特殊仪器的特点,成为POCT核酸分子诊断的新技术。

利用LFNAB进行核酸检测,通常需进行两个步骤,即靶分子扩增过程和试纸条层析过程,层析过程大多采用基于生物素-亲和素的夹心杂交法[19]。结合现有的等温扩增方法(如环介导的扩增)和信号放大法(荧光分析,电化学分析)可简化扩增过程、增加信号强度,使LFNAB具备了检测时间短、成本效益高的优点。Pavagada等[20]提出了一种无需扩增步骤直接检测内源性miR-150-5p浓度的LFIA方法,为LFNAB提供了新方向。LFNAB目前已实现对脱氧核糖核酸、16S核糖体核糖核酸、微小核糖核酸等核酸分子的快速、多重检测。但由于探针序列普遍较短,容易造成假阳性;夹心杂交法的设计、构造过程复杂,LFNAB的整体性能还有待提高。


四、商品化应用

为明确LFIA的实际商品化应用情况,在国家药品监督管理局官网进行国家医疗器械许可查询,以"免疫层析"为关键词进行检索,结果显示用于免疫层析的医疗器械共计1 249种,其中检测仪器43种(胶体金定量检测仪31种,荧光免疫层析仪12种),试剂盒1 206种(包含811种定量检测试剂盒,395种定性检测试剂盒)。在定量检测试剂盒中胶体金试剂盒共288种;荧光免疫试剂盒共514种;金磁免疫试剂盒共9种。另外,定量检测试剂盒可完成78个项目检测,包含炎性指标、肿瘤标志物、酶、激素等,其中有291种试剂盒可完成心肌损伤标志物的定量检测,225种试剂盒可完成炎症因子的定量检测。

现有的定量免疫层析试剂盒数量为定性试剂盒的2.1倍,荧光定量试剂盒数量是胶体金定量试剂盒的1.8倍,反映出LFIA正由传统的定性检测向定量检测转变,并且更多使用荧光标记物。另外,炎性指标和心肌损伤标志物远多于其他检测项目,因为这二者在疾病早期就可出现,并且疾病发病较急,说明检测项目设置更偏向实用性强、临床意义大的指标。


五、结论及展望

随着LFIA检测系统的改进与提升,其检测灵敏度不断提高,在疾病诊断、药物监测、食品安全等方面的应用愈加广泛。灵敏标记物的使用,显著放大了LFIA的检测信号;基于便携设备(如智能手机)的检测仪已研发成功,使LFIA的家用化成为可能;新型层析膜可有效减少背景荧光,使结果更加准确。实际应用中LFIA开始转向定量检测,包括核酸检测,使LFIA成为待测物分析的有效、精准、可信方法。相信不久,随着检测仪器的发展,层析膜材料的更新,更多灵敏标记物的应用,LFIA检测项目会更多、更普及;其操作方式会更加智能、便携、家用;定量结果输出也会更加快速、灵敏、准确。


利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

选自中华检验医学杂志, 2019,43(06) 

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